Polymerization and phase separation of proteins containing low-complexity (LC) domains are important factors in gene expression, mRNA processing and trafficking, and localization of translation. We have used solid-state nuclear magnetic resonance methods to characterize the molecular structure of self-assembling fibrils formed by the LC domain of the fused in sarcoma (FUS) RNA-binding protein. From the 214-residue LC domain of FUS (FUS-LC), a segment of only 57 residues forms the fibril core, while other segments remain dynamically disordered. Unlike pathogenic amyloid fibrils, FUS-LC fibrils lack hydrophobic interactions within the core and are not polymorphic at the molecular structural level. Phosphorylation of core-forming residues by DNA-dependent protein kinase blocks binding of soluble FUS-LC to FUS-LC hydrogels and dissolves phase-separated, liquid-like FUS-LC droplets. These studies offer a structural basis for understanding LC domain self-assembly, phase separation, and regulation by post-translational modification.

Two complementary approaches were used in search of the intracellular targets of the toxic PR poly-dipeptide encoded by the repeat sequences expanded in the C9orf72 form of amyotrophic lateral sclerosis. The top categories of PRn-bound proteins include constituents of non-membrane invested cellular organelles and intermediate filaments. PRn targets are enriched for the inclusion of low complexity (LC) sequences. Evidence is presented indicating that LC sequences represent the direct target of PRn binding and that interaction between the PRn poly-dipeptide and LC domains is polymer-dependent. These studies indicate that PRn-mediated toxicity may result from broad impediments to the dynamics of cell structure and information flow from gene to message to protein.

Significance A hexanucleotide repeat expansion in the first intron of the C9orf72 gene represents the most prominent form of heritable amyotrophic lateral sclerosis. Bidirectional transcription and ATG-independent translation of the expanded (GGGGCC) n repeat specifies the production of toxic glycine:arginine (GR n ) and proline:arginine (PR n ) poly-dipeptides. The present study provides evidence that the PR n poly-dipeptide binds directly to the central channel of nuclear pores, causing inhibition of both the import and export of macromolecules to and from the nucleus. Nuclear pore binding is shown to be mediated via direct interaction between the toxic PR n poly-dipeptide and polymeric forms of nuclear pore proteins enriched in phenylalanine:glycine repeats.

Summary Retroelements are the widespread jumping elements considered as major drivers for genome evolution, which can also be repurposed as gene-editing tools. Here, we determined the cryo-EM structures of eukaryotic R2 retrotransposon with ribosomal DNA target and regulatory RNAs. Combined with biochemical and sequencing analysis, we revealed two essential DNA regions, Drr and Dcr, required for R2 recognition and cleavage. The association of 3’ regulatory RNA with R2 protein accelerates the first-strand cleavage, blocks the second-strand cleavage, and initiates the reverse transcription starting from the polyA tail. Removing 3’ regulatory RNA by reverse transcription allows the association of 5’ regulatory RNA and initiates the second-strand cleavage. Our work explained the DNA recognition and supervised sequential retrotransposition mechanisms by R2 machinery, providing novel insights into the retrotransposon and application reprogramming.

Low complexity (LC) head domains 92 and 108 residues in length are, respectfully, required for assembly of neurofilament light (NFL) and desmin intermediate filaments (IFs). As studied in isolation, these IF head domains interconvert between states of conformational disorder and labile,β-strand-enriched polymers. Solid state nuclear magnetic resonance (ss-NMR) spectroscopic studies of NFL and desmin head domain polymers reveal spectral patterns consistent with structural order. A combination of intein chemistry and segmental isotope labeling allowed preparation of fully assembled NFL and desmin IFs that could also be studied by ss-NMR. Assembled IFs revealed spectra overlapping with those observed for β-strand-enriched polymers formed from the isolated NFL and desmin head domains. Phosphorylation and disease causing mutations reciprocally alter NFL and desmin head domain self-association, yet commonly impede IF assembly. These observations show how facultative structural assembly of LC domains via labile, β-strand-enriched self-interactions may broadly influence cell morphology.

Abstract Identifying new binding sites and poses that modify biological function are an important step towards drug discovery. We have identified a novel disulphide constrained peptide that interacts with the cap-binding site of eIF4E, an attractive therapeutic target that is commonly overexpressed in many cancers and plays a significant role in initiating a cancer specific protein synthesis program though binding the 5’cap (7’methyl-guanoisine) moiety found on mammalian mRNAs. The use of disulphide constrained peptides to explore intracellular biological targets is limited by their lack of cell permeability and the instability of the disulphide bond in the reducing environment of the cell, loss of which results in abrogation of binding. To overcome these challenges, the cap-binding site interaction motif was placed in a hypervariable loop on an VH domain, and then selections performed to select a molecule that could recapitulate the interaction of the peptide with the target of interest in a process termed Peptide Epitope Linker Evolution (PELE). A novel VH domain was identified that interacted with the eIF4E cap binding site with a nanomolar affinity and that could be intracellularly expressed in mammalian cells. Additionally, it was demonstrated to specifically modulate eIF4E function by decreasing cap-dependent translation and cyclin D1 expression, common effects of eIF4F complex disruption.

An evolutionarily conserved low complexity (LC) domain is found within a 152 residue segment localized to the carboxyl-terminal region of the TDP43 RNA-binding protein. This TDP43 LC domain contains ten conserved methionine residues. Self-association of this domain leads to the formation of liquid-like droplets composed of labile, cross-β polymers. Exposure of polymers to low concentrations of H2O2 leads to a phenomenon of droplet melting that can be reversed upon exposure of the oxidized protein to the MsrA and MsrB methionine sulfoxide reductase enzymes, thioredoxin, thioredoxin reductase and NADPH. Morphological features of the cross-β polymers were revealed by a method of H2O2-mediated footprinting. Similar TDP43 LC domain footprints were observed in highly polymerized, hydrogel samples, liquid-like droplet samples, and living cells. The ability of H2O2 to impede cross-β polymerization was abrogated by a prominent ALS-causing mutation that changes methionine residue 337 to valine. These observations offer potentially useful insight into the biological role of TDP43 in facilitating synapse-localized translation, as well as aberrant aggregation of the protein in neurodegenerative disease.