Ena/VASP proteins regulate the actin cytoskeleton during cell migration and morphogenesis and promote assembly of both filopodial and lamellipodial actin networks. To understand the molecular mechanisms underlying their cellular functions we used total internal reflection fluorescence microscopy to visualize VASP tetramers interacting with static and growing actin filaments in vitro. We observed multiple filament binding modes: (1) static side binding, (2) side binding with one-dimensional diffusion, and (3) processive barbed end tracking. Actin monomers antagonize side binding but promote high affinity (Kd = 9 nM) barbed end attachment. In low ionic strength buffers, VASP tetramers are weakly processive (Koff = 0.69 s−1) polymerases that deliver multiple actin monomers per barbed end–binding event and effectively antagonize filament capping. In higher ionic strength buffers, VASP requires profilin for effective polymerase and anti-capping activity. Based on our observations, we propose a mechanism that accounts for all three binding modes and provides a model for how VASP promotes actin filament assembly.

PI3Kγ is a critical immune signaling enzyme activated downstream of diverse cell surface molecules, including Ras, PKCβ activated by the IgE receptor, and Gβγ subunits released from activated GPCRs. PI3Kγ can form two distinct complexes, with the p110γ catalytic subunit binding to either a p101 or p84 regulatory subunit, with these complexes being differentially activated by upstream stimuli. Here, using a combination of cryo electron microscopy, HDX-MS, and biochemical assays, we have identified novel roles of the helical domain of p110γ in regulating lipid kinase activity of distinct PI3Kγ complexes. We defined the molecular basis for how an allosteric inhibitory nanobody potently inhibits kinase activity through rigidifying the helical domain and regulatory motif of the kinase domain. The nanobody did not block either p110γ membrane recruitment or Ras/Gβγ binding, but instead decreased ATP turnover. We also identified that p110γ can be activated by dual PKCβ helical domain phosphorylation leading to partial unfolding of an N-terminal region of the helical domain. PKCβ phosphorylation is selective for p110γ-p84 compared to p110γ-p101, driven by differential dynamics of the helical domain of these different complexes. Nanobody binding prevented PKCβ-mediated phosphorylation. Overall, this work shows an unexpected allosteric regulatory role of the helical domain of p110γ that is distinct between p110γ-p84 and p110γ-p101 and reveals how this can be modulated by either phosphorylation or allosteric inhibitory binding partners. This opens possibilities of future allosteric inhibitor development for therapeutic intervention.

PI3Kγ is a critical immune signaling enzyme activated downstream of diverse cell surface molecules, including Ras, PKCβ activated by the IgE receptor, and Gβγ subunits released from activated GPCRs. PI3Kγ can form two distinct complexes, with the p110γ catalytic subunit binding to either a p101 or p84 regulatory subunit, with these complexes being differentially activated by upstream stimuli. Here, using a combination of cryo electron microscopy, HDX-MS, and biochemical assays, we have identified novel roles of the helical domain of p110γ in regulating lipid kinase activity of distinct PI3Kγ complexes. We defined the molecular basis for how an allosteric inhibitory nanobody potently inhibits kinase activity through rigidifying the helical domain and regulatory motif of the kinase domain. The nanobody did not block either p110γ membrane recruitment or Ras/Gβγ binding, but instead decreased ATP turnover. We also identified that p110γ can be activated by dual PKCβ helical domain phosphorylation leading to partial unfolding of an N-terminal region of the helical domain. PKCβ phosphorylation is selective for p110γ-p84 compared to p110γ-p101, driven by differential dynamics of the helical domain of these different complexes. Nanobody binding prevented PKCβ-mediated phosphorylation. Overall, this work shows an unexpected allosteric regulatory role of the helical domain of p110γ that is distinct between p110γ-p84 and p110γ-p101 and reveals how this can be modulated by either phosphorylation or allosteric inhibitory binding partners. This opens possibilities of future allosteric inhibitor development for therapeutic intervention.

ABSTRACT The phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (PIP5K) family of lipid modifying enzymes generate the majority of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P 2 ) lipids found at the plasma membrane in eukaryotic cells. PI(4,5)P 2 lipids serve a critical role in regulating receptor activation, ion channel gating, endocytosis, and actin nucleation. Here we describe how PIP5K activity is regulated by cooperative binding to PI(4,5)P 2 lipids and membrane-mediated dimerization of the kinase domain. In contrast to constitutively dimeric phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase (PIP4K, type II PIPK), solution PIP5K exists in a weak monomer-dimer equilibrium. PIP5K monomers can associate with PI(4,5)P 2 containing membranes and dimerize in a protein density dependent manner. Although dispensable for PI(4,5)P 2 binding and lipid kinase activity, dimerization enhances the catalytic efficiency of PIP5K through a mechanism consistent with allosteric regulation. Additionally, dimerization amplifies stochastic variation in the kinase reaction velocity and strengthens effects such as the recently described stochastic geometry sensing. Overall, the mechanism of PIP5K membrane binding creates a broad dynamic range of lipid kinase activities that are coupled to the density of PI(4,5)P 2 and membrane bound kinase.

PI3Kγ is a critical immune signaling enzyme activated downstream of diverse cell surface molecules, including Ras, PKCβ activated by the IgE receptor, and Gβγ subunits released from activated GPCRs. PI3Kγ can form two distinct complexes, with the p110γ catalytic subunit binding to either a p101 or p84 regulatory subunit, with these complexes being differentially activated by upstream stimuli. Here using a combination of cryo electron microscopy, HDX-MS, and biochemical assays we have identified novel roles of the helical domain of p110γ in regulating lipid kinase activity of distinct PI3Kγ complexes. We defined the molecular basis for how an allosteric inhibitory nanobody potently inhibits kinase activity through rigidifying the helical domain and regulatory motif of the kinase domain. The nanobody did not block either p110γ membrane recruitment or Ras/Gβγ binding, but instead decreased ATP turnover. We also identified that p110γ can be activated by dual PKCβ helical domain phosphorylation leading to partial unfolding of an N-terminal region of the helical domain. PKCβ phosphorylation is selective for p110γ-p84 compared to p110γ-p101, driven by differential dynamics of the helical domain of these different complexes. Nanobody binding prevented PKCβ mediated phosphorylation. Overall, this works shows an unexpected allosteric regulatory role of the helical domain of p110γ that is distinct between p110γ-p84 and p110γ-p101 and reveals how this can be modulated by either phosphorylation or allosteric inhibitory binding partners. This opens possibilities of future allosteric inhibitor development for therapeutic intervention.

Abstract PI3Kγ is a critical immune signaling enzyme activated downstream of diverse cell surface molecules, including Ras, PKCβ activated by the IgE receptor, and Gβγ subunits released from activated GPCRs. PI3Kγ can form two distinct complexes, with the p110γ catalytic subunit binding to either a p101 or p84 regulatory subunit, with these complexes being differentially activated by upstream stimuli. Here using a combination of cryo electron microscopy, HDX-MS, and biochemical assays we have identified novel roles of the helical domain of p110γ in regulating lipid kinase activity of distinct PI3Kγ complexes. We defined the molecular basis for how an allosteric inhibitory nanobody potently inhibits kinase activity through rigidifying the helical domain and regulatory motif of the kinase domain. The nanobody did not block either p110γ membrane recruitment or Ras/Gβγ binding, but instead decreased ATP turnover. We also identified that p110γ can be activated by dual PKCβ helical domain phosphorylation leading to partial unfolding of an N-terminal region of the helical domain. PKCβ phosphorylation is selective for p110γ-p84 compared to p110γ-p101, driven by differential dynamics of the helical domain of these different complexes. Nanobody binding prevented PKCβ mediated phosphorylation. Overall, this works shows an unexpected allosteric regulatory role of the helical domain of p110γ that is distinct between p110γ-p84 and p110γ-p101 and reveals how this can be modulated by either phosphorylation or allosteric inhibitory binding partners. This opens possibilities of future allosteric inhibitor development for therapeutic intervention.

The class 1A phosphoinositide 3-kinase (PI3K) beta (PI3Kβ) is functionally unique in the ability to integrate signals derived from receptor tyrosine kinases (RTKs), heterotrimeric guanine nucleotide-binding protein (G-protein)-coupled receptors (GPCRs), and Rho-family GTPases. The mechanism by which PI3Kβ prioritizes interactions with various membrane tethered signaling inputs, however, remains unclear. Previous experiments have not been able to elucidate whether interactions with membrane-tethered proteins primarily control PI3Kβ localization versus directly modulate lipid kinase activity. To address this gap in our understanding of PI3Kβ regulation, we established an assay to directly visualize and decipher how three binding interactions regulate PI3Kβ when presented to the kinase in a biologically relevant configuration on supported lipid bilayers. Using single molecule Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy, we determined the mechanism controlling membrane localization of PI3Kβ, prioritization of signaling inputs, and lipid kinase activation. We find that auto-inhibited PI3Kβ must first cooperatively engage a single RTK-derived tyrosine phosphorylated (pY) peptide before it can engage either GβGγ or Rac1(GTP). Although pY peptides strongly localize PI3Kβ to membranes, they only modestly stimulate lipid kinase activity. In the presence of either pY/GβGγ or pY/Rac1(GTP), PI3Kβ activity is dramatically enhanced beyond what can be explained by the increase in membrane avidity for these complexes. Instead, PI3Kβ is synergistically activated by pY/GβGγ and pY/Rac1(GTP) through a mechanism of allosteric regulation.

Abstract The class IB phosphoinositide 3-kinase (PI3K), PI3Kγ, is a master regulator of immune cell function, and a promising drug target for both cancer and inflammatory diseases. Critical to PI3Kγ function is the association of the p110γ catalytic subunit to either a p101 or p84 regulatory subunit, which mediates activation by G-protein coupled receptors (GPCRs). Here, we report the cryo-EM structure of a heterodimeric PI3Kγ complex, p110γ-p101. This structure reveals a unique assembly of catalytic and regulatory subunits that is distinct from other class I PI3K complexes. p101 mediates activation through its Gβγ binding domain, recruiting the heterodimer to the membrane and allowing for engagement of a secondary Gβγ binding site in p110γ. Multiple oncogenic mutations mapped to these novel interfaces and enhanced Gβγ activation. A nanobody that specifically binds to the p101-Gβγ interface blocks activation providing a novel tool to study and target p110γ-p101-specific signaling events in vivo .

PI3Kγ is a critical immune signaling enzyme activated downstream of diverse cell surface molecules, including Ras, PKCβ activated by the IgE receptor, and Gβγ subunits released from activated GPCRs. PI3Kγ can form two distinct complexes, with the p110γ catalytic subunit binding to either a p101 or p84 regulatory subunit, with these complexes being differentially activated by upstream stimuli. Here using a combination of Cryo electron microscopy, HDX-MS, and biochemical assays we have identified novel roles of the helical domain of p110γ in regulating lipid kinase activity of distinct PI3Kγ complexes. We defined the molecular basis for how an allosteric inhibitory nanobody potently inhibits kinase activity through rigidifying the helical domain and regulatory motif of the kinase domain. The nanobody did not block either p110γ membrane recruitment or Ras/Gβγ binding, but instead decreased ATP turnover. We also identified that p110γ can be activated by dual PKCβ helical domain phosphorylation leading to partial unfolding of an N-terminal region of the helical domain. PKCβ phosphorylation is selective for p110γ-p84 compared to p110γ-p101, driven by differential dynamics of the helical domain of these different complexes. Nanobody binding prevented PKCβ mediated phosphorylation. Overall, this works shows an unexpected allosteric regulatory role of the helical domain of p110γ that is distinct between p110γ-p84 and p110γ-p101, and reveals how this can be modulated by either phosphorylation or allosteric inhibitory binding partners. This opens possibilities of future allosteric inhibitor development for therapeutic intervention.

Eukaryotic DNA is packaged into nucleosomes, the smallest repeating unit of chromatin. The positions of nucleosomes determine the relative accessibility of genomic DNA. Several protocols exist for mapping nucleosome positions in eukaryotic genomes in order to study the relationship between chromatin structure and DNA-dependent processes. These nucleosome mapping protocols can be laborious and, at minimum, require two to three days to isolate nucleosome-protected DNA fragments. We have developed a streamlined protocol for mapping nucleosomes from S. cerevisiae liquid culture or from patches on solid agar. This method isolates nucleosome-sized footprints in three hours using 1.5 ml tubes with minimal chemical waste. We validate that these footprints match those produced by previously published methods and we demonstrate that our protocol works for N. crassa and S. pombe. A slightly modified protocol can be used for isolation of nucleosome-protected DNA fragments from a variety of wild fungal specimens thereby providing a simple, easily multiplexed and unified strategy to map nucleosome positions in model and non-model fungi. Finally, we demonstrate recovery of nucleosome footprints from the diploid myeloid leukemia cell line PLB-985 in less than three hours using an abbreviated version of the same protocol. With reduced volume and incubation times and a streamlined workflow, the described method should be compatible with high-throughput, automated creation of MNase-seq libraries. We believe this simple validated method for rapidly producing sequencing-ready nucleosome footprints from a variety of organisms will make nucleosome mapping studies widely accessible to researchers globally.