Abstract Centromere protein A (CENP‐A), a centromere‐specific histone H3 variant, is crucial for kinetochore positioning and chromosome segregation. However, its regulatory mechanism in human cells remains incompletely understood. A structure‐activity relationship (SAR) study of the cell‐cycle‐arresting indole terpenoid mimic JP18 leads to the discovery of two more potent analogs, (+)‐6‐Br‐JP18 and (+)‐6‐Cl‐JP18. Tubulin is identified as a potential cellular target of these halogenated analogs by using the drug affinity responsive target stability (DARTS) based method. X‐ray crystallography analysis reveals that both molecules bind to the colchicine‐binding site of β‐tubulin. Treatment of human cells with microtubule‐targeting agents (MTAs), including these two compounds, results in CENP‐A accumulation by destabilizing Cdh1, a co‐activator of the anaphase‐promoting complex/cyclosome (APC/C) E3 ubiquitin ligase. This study establishes a link between microtubule dynamics and CENP‐A accumulation using small‐molecule tools and highlights the role of Cdh1 in CENP‐A proteolysis.

Abstract Centromere protein A (CENP-A) is a centromere-specific protein that determines kinetochore positioning and the accuracy of chromosome segregation. Despite its recognized importance in maintaining mitotic fidelity, the molecular details of CENP-A regulation in mitosis are still obscure. We performed a structure-activity relationship (SAR) study of the cell cycle-arresting indole terpenoid mimic JP18 and identified two more potent analogues, (+)-6-Br-JP18 and (+)-6-Cl-JP18. Tubulin was identified as a potential protein target of these two halogenated analogues by using the drug affinity responsive target stability (DARTS) based method. X-ray crystallographic analysis determined that (+)-6-Br-JP18 and (+)-6-Cl-JP18 bind to the colchicine-binding site of β-tubulin. We further found that treatment of cancer cells with microtubule-targeting agents (MTAs), including these two compounds, upregulated CENP-A by destabilizing Cdh1, an E3 ubiquitin ligase component. The mechanistic study revealed that Cdh1 mediates proteolysis of CENP-A in mitosis, specifying the role of Cdh1 in maintaining mitotic fidelity.

Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) has emerged as a key regulator in the treatment of cancer metastasis because of its involvement in the formation of cell plate pseudopods and effects on cell migration. In this study, we found that incarvine C, a natural product isolated from Incarvillea sinensis, and its seven analogues exhibited antitumour activity by inhibiting cell cytoskeleton formation, with moderate cytotoxicity. Accordingly, these compounds inhibited the cytoskeleton-mediated migration and invasion of MDA-MB-231 cells, with inhibition rates ranging from 37.30 % to 69.72 % and 51.27 % to 70.90 % in vitro, respectively. Moreover, they induced G2/M phase cell cycle arrest in MDA-MB-231 cells. A pull-down assay revealed that the interaction between Rac1 and its downstream effector protein PAK1 was inhibited by these compounds and that the compound Ano-6 exhibited substantial activity, with an inhibition rate of more than 90 %. Molecular docking showed that incarvine C and its analogues could bind to the nucleotide-binding pocket of Rac1, maintaining high levels of inactivated Rac1. As Ano-6 exhibited significant activity in vitro, its anti-cancer activity was tested in vivo. Four weeks of oral treatment with Ano-6 was well-tolerated in mice, and it induced a potential anti-tumour response in xenografts of MDA-MB-231 cells. Further studies demonstrated that Ano-6 was enriched in tumour tissues after 2 h of administration and induced an increase in the number of dead tumour cells. In summary, these findings not only reveal the mechanism of incarvine C but also provide a new molecular template for Rac1 inhibitors and identify a promising candidate for breast cancer treatment.