Circulating trimethylamine-N-oxide (TMAO) levels are strongly associated with atherosclerosis. We now examine genetic, dietary, and hormonal factors regulating TMAO levels. We demonstrate that two flavin mono-oxygenase family members, FMO1 and FMO3, oxidize trimethylamine (TMA), derived from gut flora metabolism of choline, to TMAO. Further, we show that FMO3 exhibits 10-fold higher specific activity than FMO1. FMO3 overexpression in mice significantly increases plasma TMAO levels while silencing FMO3 decreases TMAO levels. In both humans and mice, hepatic FMO3 expression is reduced in males compared to females. In mice, this reduction in FMO3 expression is due primarily to downregulation by androgens. FMO3 expression is induced by dietary bile acids by a mechanism that involves the farnesoid X receptor (FXR), a bile acid-activated nuclear receptor. Analysis of natural genetic variation among inbred strains of mice indicates that FMO3 and TMAO are significantly correlated, and TMAO levels explain 11% of the variation in atherosclerosis.

Air pollution is associated with significant adverse health effects, including increased cardiovascular morbidity and mortality. Exposure to particulate matter with an aerodynamic diameter of <2.5 μm (PM 2.5 ) increases ischemic cardiovascular events and promotes atherosclerosis. Moreover, there is increasing evidence that the smallest pollutant particles pose the greatest danger because of their high content of organic chemicals and prooxidative potential. To test this hypothesis, we compared the proatherogenic effects of ambient particles of <0.18 μm (ultrafine particles) with particles of <2.5 μm in genetically susceptible (apolipoprotein E–deficient) mice. These animals were exposed to concentrated ultrafine particles, concentrated particles of <2.5 μm, or filtered air in a mobile animal facility close to a Los Angeles freeway. Ultrafine particle–exposed mice exhibited significantly larger early atherosclerotic lesions than mice exposed to PM 2.5 or filtered air. Exposure to ultrafine particles also resulted in an inhibition of the antiinflammatory capacity of plasma high-density lipoprotein and greater systemic oxidative stress as evidenced by a significant increase in hepatic malondialdehyde levels and upregulation of Nrf2-regulated antioxidant genes. We conclude that ultrafine particles concentrate the proatherogenic effects of ambient PM and may constitute a significant cardiovascular risk factor.

The relationships between the levels of transcripts and the levels of the proteins they encode have not been examined comprehensively in mammals, although previous work in plants and yeast suggest a surprisingly modest correlation. We have examined this issue using a genetic approach in which natural variations were used to perturb both transcript levels and protein levels among inbred strains of mice. We quantified over 5,000 peptides and over 22,000 transcripts in livers of 97 inbred and recombinant inbred strains and focused on the 7,185 most heritable transcripts and 486 most reliable proteins. The transcript levels were quantified by microarray analysis in three replicates and the proteins were quantified by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry using O(18)-reference-based isotope labeling approach. We show that the levels of transcripts and proteins correlate significantly for only about half of the genes tested, with an average correlation of 0.27, and the correlations of transcripts and proteins varied depending on the cellular location and biological function of the gene. We examined technical and biological factors that could contribute to the modest correlation. For example, differential splicing clearly affects the analyses for certain genes; but, based on deep sequencing, this does not substantially contribute to the overall estimate of the correlation. We also employed genome-wide association analyses to map loci controlling both transcript and protein levels. Surprisingly, little overlap was observed between the protein- and transcript-mapped loci. We have typed numerous clinically relevant traits among the strains, including adiposity, lipoprotein levels, and tissue parameters. Using correlation analysis, we found that a low number of clinical trait relationships are preserved between the protein and mRNA gene products and that the majority of such relationships are specific to either the protein levels or transcript levels. Surprisingly, transcript levels were more strongly correlated with clinical traits than protein levels. In light of the widespread use of high-throughput technologies in both clinical and basic research, the results presented have practical as well as basic implications.

Obesity is a highly heritable disease driven by complex interactions between genetic and environmental factors. Human genome-wide association studies (GWAS) have identified a number of loci contributing to obesity; however, a major limitation of these studies is the inability to assess environmental interactions common to obesity. Using a systems genetics approach, we measured obesity traits, global gene expression, and gut microbiota composition in response to a high-fat/high-sucrose (HF/HS) diet of more than 100 inbred strains of mice. Here we show that HF/HS feeding promotes robust, strain-specific changes in obesity that are not accounted for by food intake and provide evidence for a genetically determined set point for obesity. GWAS analysis identified 11 genome-wide significant loci associated with obesity traits, several of which overlap with loci identified in human studies. We also show strong relationships between genotype and gut microbiota plasticity during HF/HS feeding and identify gut microbial phylotypes associated with obesity.

Recent studies indicate both clinical and mechanistic links between atherosclerotic heart disease and intestinal microbial metabolism of certain dietary nutrients producing trimethylamine N-oxide (TMAO). Here we test the hypothesis that gut microbial transplantation can transmit choline diet-induced TMAO production and atherosclerosis susceptibility. First, a strong association was noted between atherosclerotic plaque and plasma TMAO levels in a mouse diversity panel (n = 22 strains, r = 0.38; p = 0.0001). An atherosclerosis-prone and high TMAO-producing strain, C57BL/6J, and an atherosclerosis-resistant and low TMAO-producing strain, NZW/LacJ, were selected as donors for cecal microbial transplantation into apolipoprotein e null mice in which resident intestinal microbes were first suppressed with antibiotics. Trimethylamine (TMA) and TMAO levels were initially higher in recipients on choline diet that received cecal microbes from C57BL/6J inbred mice; however, durability of choline diet-dependent differences in TMA/TMAO levels was not maintained to the end of the study. Mice receiving C57BL/6J cecal microbes demonstrated choline diet-dependent enhancement in atherosclerotic plaque burden as compared with recipients of NZW/LacJ microbes. Microbial DNA analyses in feces and cecum revealed transplantation of donor microbial community features into recipients with differences in taxa proportions between donor strains that were transmissible to recipients and that tended to show coincident proportions with TMAO levels. Proportions of specific taxa were also identified that correlated with plasma TMAO levels in donors and recipients and with atherosclerotic lesion area in recipients. Atherosclerosis susceptibility may be transmitted via transplantation of gut microbiota. Gut microbes may thus represent a novel therapeutic target for modulating atherosclerosis susceptibility. 

Background

 Recent human and animal studies suggest that gut microbes can influence atherosclerosis via generation of trimethylamine N-oxide (TMAO). 

Results

 Cecal microbial transplantation from atherosclerosis-prone versus -resistant inbred strains of mice transmitted enhanced choline diet-dependent atherosclerosis and TMAO levels. 

Conclusion

 Atherosclerosis susceptibility can be transmitted with gut microbial transplantation. 

Significance

 Gut microbes participate in atherosclerosis susceptibility and are thus a potential therapeutic target.

Systems genetics relies on common genetic variants to elucidate biologic networks contributing to complex disease-related phenotypes. Mice are ideal model organisms for such approaches, but linkage analysis has been only modestly successful due to low mapping resolution. Association analysis in mice has the potential of much better resolution, but it is confounded by population structure and inadequate power to map traits that explain less than 10% of the variance, typical of mouse quantitative trait loci (QTL). We report a novel strategy for association mapping that combines classic inbred strains for mapping resolution and recombinant inbred strains for mapping power. Using a mixed model algorithm to correct for population structure, we validate the approach by mapping over 2500 cis -expression QTL with a resolution an order of magnitude narrower than traditional QTL analysis. We also report the fine mapping of metabolic traits such as plasma lipids. This resource, termed the Hybrid Mouse Diversity Panel, makes possible the integration of multiple data sets and should prove useful for systems-based approaches to complex traits and studies of gene-by-environment interactions.

We performed silencing and overexpression studies of flavin containing monooxygenase (FMO) 3 in hyperlipidemic mouse models to examine its effects on trimethylamine N-oxide (TMAO) levels and atherosclerosis. Knockdown of hepatic FMO3 in LDL receptor knockout mice using an antisense oligonucleotide resulted in decreased circulating TMAO levels and atherosclerosis. Surprisingly, we also observed significant decreases in hepatic lipids and in levels of plasma lipids, ketone bodies, glucose, and insulin. FMO3 overexpression in transgenic mice, on the other hand, increased hepatic and plasma lipids. Global gene expression analyses suggested that these effects of FMO3 on lipogenesis and gluconeogenesis may be mediated through the PPARα and Kruppel-like factor 15 pathways. In vivo and in vitro results were consistent with the concept that the effects were mediated directly by FMO3 rather than trimethylamine/TMAO; in particular, overexpression of FMO3 in the human hepatoma cell line, Hep3B, resulted in significantly increased glucose secretion and lipogenesis. Our results indicate a major role for FMO3 in modulating glucose and lipid homeostasis in vivo, and they suggest that pharmacologic inhibition of FMO3 to reduce TMAO levels would be confounded by metabolic interactions.