Abstract Mesoscopic photoacoustic imaging (PAI) enables label‐free visualization of vascular networks in tissues with high contrast and resolution. Segmenting these networks from 3D PAI data and interpreting their physiological and pathological significance is crucial yet challenging due to the time‐consuming and error‐prone nature of current methods. Deep learning offers a potential solution; however, supervised analysis frameworks typically require human‐annotated ground‐truth labels. To address this, an unsupervised image‐to‐image translation deep learning model is introduced, the Vessel Segmentation Generative Adversarial Network (VAN‐GAN). VAN‐GAN integrates synthetic blood vessel networks that closely resemble real‐life anatomy into its training process and learns to replicate the underlying physics of the PAI system in order to learn how to segment vasculature from 3D photoacoustic images. Applied to a diverse range of in silico, in vitro, and in vivo data, including patient‐derived breast cancer xenograft models and 3D clinical angiograms, VAN‐GAN demonstrates its capability to facilitate accurate and unbiased segmentation of 3D vascular networks. By leveraging synthetic data, VAN‐GAN reduces the reliance on manual labeling, thus lowering the barrier to entry for high‐quality blood vessel segmentation (F1 score: VAN‐GAN vs. U‐Net = 0.84 vs. 0.87) and enhancing preclinical and clinical research into vascular structure and function.

Abstract Photoacoustic mesoscopy visualises vascular architecture and associated tissue structures at high resolution at up to 3 mm depth. The technique has shown promise in both preclinical and clinical imaging studies, with possible applications in oncology and dermatology, however, the accuracy and precision of photoacoustic mesoscopy has not been well established. Here, we present a performance evaluation of a commercial photoacoustic mesoscopy system for imaging vascular structures. Typical artefact types are first highlighted and limitations due to non-isotropic illumination and detection are evaluated with respect to rotation, angularity, and depth of the target. Then, using tailored phantoms and mouse models we demonstrate high system precision, with acceptable coefficients of variation (COV) between repeated scans (short term (1h): COV=1.2%; long term (25 days): COV=9.6%), from target repositioning (without: COV=1.2%, with: COV=4.1%), or from varying in vivo user experience (experienced: COV=15.9%, unexperienced: COV=20.2%). While our findings support the robustness of the technique, they also underscore the general challenges of limited field-of-view photoacoustic systems in accurately imaging vessel-like structures, thereby guiding users to correctly interpret biologically-relevant information.

SignificanceThe estimation of tissue optical properties using diffuse optics has found a range of applications in disease detection, therapy monitoring, and general health care. Biomarkers derived from the estimated optical absorption and scattering coefficients can reflect the underlying progression of many biological processes in tissues.AimComplex light–tissue interactions make it challenging to disentangle the absorption and scattering coefficients, so dedicated measurement systems are required. We aim to help readers understand the measurement principles and practical considerations needed when choosing between different estimation methods based on diffuse optics.ApproachThe estimation methods can be categorized as: steady state, time domain, time frequency domain (FD), spatial domain, and spatial FD. The experimental measurements are coupled with models of light–tissue interactions, which enable inverse solutions for the absorption and scattering coefficients from the measured tissue reflectance and/or transmittance.ResultsThe estimation of tissue optical properties has been applied to characterize a variety of ex vivo and in vivo tissues, as well as tissue-mimicking phantoms. Choosing a specific estimation method for a certain application has to trade-off its advantages and limitations.ConclusionOptical absorption and scattering property estimation is an increasingly important and accessible approach for medical diagnosis and health monitoring.

ABSTRACT Significance Photoacoustic imaging (PAI) provides contrast based on the concentration of optical absorbers in tissue, enabling the assessment of functional physiological parameters such as blood oxygen saturation (sO 2 ). Recent evidence suggests that variation in melanin levels in the epidermis leads to measurement biases in optical technologies, which could potentially limit the application of these biomarkers in diverse populations. Aim To examine the effects of skin melanin pigmentation on photoacoustic imaging and oximetry. Approach We evaluated the effects of skin tone in PAI using a computational skin model, two-layer melanin-containing tissue-mimicking phantoms, and mice of a consistent genetic background with varying pigmentations. The computational skin model was validated by simulating the diffuse reflectance spectrum using the adding-doubling method, allowing us to assign our simulation parameters to approximate Fitzpatrick skin types. Monte Carlo simulations and acoustic simulations were run to obtain idealised photoacoustic images of our skin model. Photoacoustic images of the phantoms and mice were acquired using a commercial instrument. Reconstructed images were processed with linear spectral unmixing to estimate blood oxygenation. Linear unmixing results were compared with a learned unmixing approach based on gradient-boosted regression. Results Our computational skin model was consistent with representative literature for in vivo skin reflectance measurements. We observed consistent spectral colouring effects across all model systems, with an overestimation of sO 2 and more image artefacts observed with increasing melanin concentration. The learned unmixing approach reduced the measurement bias, but predictions made at lower blood sO 2 still suffered from a skin tone-dependent effect. Conclusion PAI demonstrates measurement bias, including an overestimation of blood sO 2 , in higher Fitzpatrick skin types. Future research should aim to characterise this effect in humans to ensure equitable application of the technology.

Abstract Introduction Photoacoustic imaging (PAI) enables the detection of blood haemoglobin (HB) concentration and oxygenation (SO 2 ) with high contrast and resolution. To date, the relationship between photoacoustically determined total Haemoglobin (THb MSOT ) and oxygen saturation (SO 2 ) biomarkers and the underlying biochemical blood parameters has yet to be established. We sought to explore these relationships in a species-specific manner. Methods Experiments were performed in vitro using tissue-mimicking agar phantoms. Blood was extracted from mouse, rat, human and naked mole-rat ( Heterocephalus glaber ), anticoagulated in EDTA and measured within 48 hours. THb MSOT and SO 2 MSOT were measured using a commercial photoacoustic tomography system (InVision 128, iThera Medical GmBH). Biochemical blood parameters such as haemoglobin concentration (HB, g/dL), haematocrit (HCT, %) and red blood cell count (RBC, μL -1 ) were assessed using a haematology analyser (Mythic 18 Vet, Woodley Equipment). Results A significant correlation was observed between THb MSOT and biochemical HB, HCT and RBC in mouse and rat blood. Moreover, PAI accurately recapitulated inter-species variations in HB and HCT between mouse and rat blood and resolved differences in the oxygen dissociation curves between human, mouse and rat. With these validation data in hand, we applied PAI to studies of blood obtained from naked mole-rats and could confirm the high oxygen affinity of this species in comparison to other rodents of similar size. Conclusion In summary, our results demonstrate the high sensitivity of photoacoustically determined biomarkers towards species-specific variations in vitro .

Abstract Innovations in imaging hardware have led to a revolution in our ability to visualise vascular networks in 3D at high resolution. The segmentation of microvascular networks from these 3D image volumes and interpretation of their meaning in the context of physiological and pathological processes unfortunately remains a time consuming and error-prone task. Deep learning has the potential to solve this problem, but current supervised analysis frameworks require human-annotated ground truth labels. To overcome these limitations, we present an unsupervised image-to-image translation deep learning model called the vessel segmentation generative adversarial network (VAN-GAN). VAN-GAN integrates synthetic blood vessel networks that closely resemble real-life anatomy into its training process and learns to replicate the underlying physics of an imaging system in order to learn how to segment vasculature from 3D biomedical images. To demonstrate the potential of VAN-GAN, the framework was applied to the challenge of segmenting vascular networks from images acquired using mesoscopic photoacoustic imaging (PAI). With a variety of in silico , in vitro and in vivo pathophysiological data, including patient-derived breast cancer xenograft models, we show that VAN-GAN facilitates accurate and unbiased segmentation of 3D vascular networks from PAI volumes. By leveraging synthetic data to reduce the reliance on manual labelling, VAN-GAN lower the barriers to entry for high-quality blood vessel segmentation to benefit imaging studies of vascular structure and function.

ABSTRACT Mesoscopic photoacoustic imaging (PAI) enables non-invasive visualisation of tumour vasculature and has the potential to assess prognosis and therapeutic response. Currently, evaluating vasculature using mesoscopic PAI involves visual or semi-quantitative 2D measurements, which fail to capture 3D vessel network complexity, and lack robust ground truths for assessment of segmentation accuracy. Here, we developed an in silico , phantom, in vivo , and ex vivo -validated end-to-end framework to quantify 3D vascular networks captured using mesoscopic PAI. We applied our framework to evaluate the capacity of rule-based and machine learning-based segmentation methods, with or without vesselness image filtering, to preserve blood volume and network structure by employing topological data analysis. We first assessed segmentation performance against ground truth data of in silico synthetic vasculatures and a photoacoustic string phantom. Our results indicate that learning-based segmentation best preserves vessel diameter and blood volume at depth, while rule-based segmentation with vesselness image filtering accurately preserved network structure in superficial vessels. Next, we applied our framework to breast cancer patient-derived xenografts (PDXs), with corresponding ex vivo immunohistochemistry. We demonstrated that the above segmentation methods can reliably delineate the vasculature of 2 breast PDX models from mesoscopic PA images. Our results underscore the importance of evaluating the choice of segmentation method when applying mesoscopic PAI as a tool to evaluate vascular networks in vivo .

SignificancePhotoacoustic imaging (PAI) promises to measure spatially resolved blood oxygen saturation but suffers from a lack of accurate and robust spectral unmixing methods to deliver on this promise. Accurate blood oxygenation estimation could have important clinical applications from cancer detection to quantifying inflammation.AimWe address the inflexibility of existing data-driven methods for estimating blood oxygenation in PAI by introducing a recurrent neural network architecture.ApproachWe created 25 simulated training dataset variations to assess neural network performance. We used a long short-term memory network to implement a wavelength-flexible network architecture and proposed the Jensen–Shannon divergence to predict the most suitable training dataset.ResultsThe network architecture can flexibly handle the input wavelengths and outperforms linear unmixing and the previously proposed learned spectral decoloring method. Small changes in the training data significantly affect the accuracy of our method, but we find that the Jensen–Shannon divergence correlates with the estimation error and is thus suitable for predicting the most appropriate training datasets for any given application.ConclusionsA flexible data-driven network architecture combined with the Jensen–Shannon divergence to predict the best training data set provides a promising direction that might enable robust data-driven photoacoustic oximetry for clinical use cases.

Abstract Objective: The formation of functional vasculature in solid tumours enables delivery of oxygen and nutrients, and is vital for effective treatment with chemotherapeutic agents. Longitudinal characterisation of vascular networks can be enabled using mesoscopic photoacoustic imaging, but requires accurate image co-registration to precisely assess local changes across disease development or in response to therapy. Co-registration in photoacoustic imaging is challenging due to the complex nature of the generated signal, including the sparsity of data, artefacts related to the illumination/detection geometry, scan-to-scan technical variability, and biological variability, such as transient changes in perfusion. To better inform the choice of co-registration algorithms, we compared five open-source methods, in physiological and pathological tissues, with the aim of aligning evolving vascular networks in tumours imaged over growth at different time-points. Approach: Co-registration techniques were applied to 3D vascular images acquired with photoacoustic mesoscopy from murine ears and breast cancer patient-derived xenografts, at a fixed time-point and longitudinally. Images were pre-processed and segmented using an unsupervised generative adversarial network. To compare co-registration quality in different settings, pairs of fixed and moving intensity images and/or segmentations were fed into five methods split into the following categories: affine intensity-based using 1)mutual information (MI) or 2)normalised cross-correlation (NCC) as optimisation metrics, affine shape-based using 3)NCC applied to distance-transformed segmentations or 4)iterative closest point algorithm, and deformable weakly supervised deep learning-based using 5)LocalNet co-registration. Percent-changes in Dice coefficients, surface distances, MI, structural similarity index measure and target registration errors were evaluated. Main results: Co-registration using MI or NCC provided similar alignment performance, better than shape-based methods. LocalNet provided accurate co-registration of substructures by optimising subfield deformation throughout the volumes, outperforming other methods, especially in the longitudinal breast cancer xenograft dataset by minimising target registration errors. Significance: We showed the feasibility of co-registering repeatedly or longitudinally imaged vascular networks in photoacoustic mesoscopy, taking a step towards longitudinal quantitative characterisation of these complex structures. These tools open new outlooks for monitoring tumour angiogenesis at the meso-scale and for quantifying treatment-induced co-localised alterations in the vasculature.

Hypoxia (low-oxygen) is one of the most common characteristics of solid tumours. Exploiting tumour hypoxia to reductively activate Pt(IV) prodrugs has the potential to deliver toxic Pt(II) selectively and thus overcome the systemic toxicity issues of traditional Pt(II) therapies. However, our current understanding of the behaviour of Pt(IV) prodrugs in hypoxia is limited. Here, we evaluated and compared the aryl carbamate fluorogenic Pt(IV) complexes, CisNap and CarboNap, as well as the previously reported OxaliNap, as potential hypoxia-activated Pt(IV) (HAPt) prodrugs. Low intracellular oxygen concentrations (<0.1%) induced the greatest changes in the respective fluorescence emission channels. However, no correlation between reduction under hypoxic conditions and toxicity was observed, except in the case for CarboNap, which displayed significant hypoxia-dependent toxicity. Other aryl carbamate Pt(IV) derivatives (including non-fluorescent analogues) mirrored these observations, where carboplatin(IV) derivative CarboPhen displayed a hypoxia-selective cytotoxicity similar to that of CarboNap. These findings underscore the need to perform extensive structure activity relationship studies on the cytotoxicity of Pt(IV) complexes under normoxic and hypoxic conditions.