Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a novel, viral-induced respiratory disease that in ∼10-15% of patients progresses to acute respiratory distress syndrome (ARDS) triggered by a cytokine storm. In this Perspective, autopsy results and literature are presented supporting the hypothesis that a little known yet powerful function of neutrophils-the ability to form neutrophil extracellular traps (NETs)-may contribute to organ damage and mortality in COVID-19. We show lung infiltration of neutrophils in an autopsy specimen from a patient who succumbed to COVID-19. We discuss prior reports linking aberrant NET formation to pulmonary diseases, thrombosis, mucous secretions in the airways, and cytokine production. If our hypothesis is correct, targeting NETs directly and/or indirectly with existing drugs may reduce the clinical severity of COVID-19.

In severe cases of coronavirus disease 2019 (COVID-19), viral pneumonia progresses to respiratory failure. Neutrophil extracellular traps (NETs) are extracellular webs of chromatin, microbicidal proteins, and oxidant enzymes that are released by neutrophils to contain infections. However, when not properly regulated, NETs have the potential to propagate inflammation and microvascular thrombosis — including in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome. We now report that sera from patients with COVID-19 have elevated levels of cell-free DNA, myeloperoxidase-DNA (MPO-DNA), and citrullinated histone H3 (Cit-H3); the latter 2 are specific markers of NETs. Highlighting the potential clinical relevance of these findings, cell-free DNA strongly correlated with acute-phase reactants, including C-reactive protein, D-dimer, and lactate dehydrogenase, as well as absolute neutrophil count. MPO-DNA associated with both cell-free DNA and absolute neutrophil count, while Cit-H3 correlated with platelet levels. Importantly, both cell-free DNA and MPO-DNA were higher in hospitalized patients receiving mechanical ventilation as compared with hospitalized patients breathing room air. Finally, sera from individuals with COVID-19 triggered NET release from control neutrophils in vitro. Future studies should investigate the predictive power of circulating NETs in longitudinal cohorts and determine the extent to which NETs may be novel therapeutic targets in severe COVID-19.

Toll–IL-1–resistance (TIR) domain–containing adaptor-inducing IFN-β (TRIF)–related adaptor molecule (TRAM) is the fourth TIR domain–containing adaptor protein to be described that participates in Toll receptor signaling. Like TRIF, TRAM activates interferon regulatory factor (IRF)-3, IRF-7, and NF-κB-dependent signaling pathways. Toll-like receptor (TLR)3 and 4 activate these pathways to induce IFN-α/β, regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES), and γ interferon–inducible protein 10 (IP-10) expression independently of the adaptor protein myeloid differentiation factor 88 (MyD88). Dominant negative and siRNA studies performed here demonstrate that TRIF functions downstream of both the TLR3 (dsRNA) and TLR4 (LPS) signaling pathways, whereas the function of TRAM is restricted to the TLR4 pathway. TRAM interacts with TRIF, MyD88 adaptor–like protein (Mal)/TIRAP, and TLR4 but not with TLR3. These studies suggest that TRIF and TRAM both function in LPS-TLR4 signaling to regulate the MyD88-independent pathway during the innate immune response to LPS.

Interferon regulatory factors (IRFs) are critical components of virus-induced immune activation and type I interferon regulation. IRF3 and IRF7 are activated in response to a variety of viruses or after engagement of Toll-like receptor (TLR) 3 and TLR4 by double-stranded RNA and lipopolysaccharide, respectively. The activation of IRF5, is much more restricted. Here we show that in contrast to IRF3 and IRF7, IRF5 is not a target of the TLR3 signaling pathway but is activated by TLR7 or TLR8 signaling. We also demonstrate that MyD88, interleukin 1 receptor-associated kinase 1, and tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 are required for the activation of IRF5 and IRF7 in the TLR7 signaling pathway. Moreover, ectopic expression of IRF5 enabled type I interferon production in response to TLR7 signaling, whereas knockdown of IRF5 by small interfering RNA reduced type I interferon induction in response to the TLR7 ligand, R-848. IRF5 and IRF7, therefore, emerge from these studies as critical mediators of TLR7 signaling. Interferon regulatory factors (IRFs) are critical components of virus-induced immune activation and type I interferon regulation. IRF3 and IRF7 are activated in response to a variety of viruses or after engagement of Toll-like receptor (TLR) 3 and TLR4 by double-stranded RNA and lipopolysaccharide, respectively. The activation of IRF5, is much more restricted. Here we show that in contrast to IRF3 and IRF7, IRF5 is not a target of the TLR3 signaling pathway but is activated by TLR7 or TLR8 signaling. We also demonstrate that MyD88, interleukin 1 receptor-associated kinase 1, and tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 are required for the activation of IRF5 and IRF7 in the TLR7 signaling pathway. Moreover, ectopic expression of IRF5 enabled type I interferon production in response to TLR7 signaling, whereas knockdown of IRF5 by small interfering RNA reduced type I interferon induction in response to the TLR7 ligand, R-848. IRF5 and IRF7, therefore, emerge from these studies as critical mediators of TLR7 signaling. Members of the Toll-like receptor family are essential recognition and signaling components of mammalian anti-viral host defense (1Janeway Jr., C.A. Medzhitov R. Annu. Rev. Immunol. 2002; 20: 197-216Crossref PubMed Scopus (6190) Google Scholar). TLR3, 1The abbreviations used are: TLR, Toll-like receptor; VSV, vesicular stomatitis virus; pDC, plasmacytoid dendritic cell; IFN, interferon; IRF, interferon regulatory factor; dsRNA, double-stranded RNA; LPS, lipopolysaccharide; NDV, Newcastle disease virus; SeV, Sendai virus; IKK, IκB kinase; siRNA, small interfering RNA; IRAK, interleukin 1 receptor-associated kinase 1; TRAF, tumor necrosis factor receptor-associated factor; DN, dominant negative; UAS, upstream activation sequence; GFP, green fluorescent protein; pI:C, poly(I) poly(C); TBK1, TANK binding kinase 1; GST, glutathione S-transferase; HEK cells, human embryonic kidney cells; TRIF, TIR-domain containing adapter inducing IFNβ. TLR7, TLR8, and TLR9 recognize viral nucleic acids and induce type I IFNs. TLR7 and TLR8 are similar in sequence and together with TLR9 form an evolutionarily related subgroup within the TLR superfamily (2Chuang T.H. Ulevitch R.J. Eur. Cytokine Netw. 2000; 11: 372-378PubMed Google Scholar, 3Du X. Poltorak A. Wei Y. Beutler B. Eur. Cytokine Netw. 2000; 11: 362-371PubMed Google Scholar). Whereas unmethylated CpG DNA (4Hemmi H. Takeuchi O. Kawai T. Kaisho T. Sato S. Sanjo H. Matsumoto M. Hoshino K. Wagner H. Takeda K. Akira S. Nature. 2000; 408: 740-745Crossref PubMed Scopus (5380) Google Scholar), herpes simplex virus (HSV) type 1 (5Krug A. Luker G.D. Barchet W. Leib D.A. Akira S. Colonna M. Blood. 2004; 103: 1433-1437Crossref PubMed Scopus (572) Google Scholar), and HSV type 2 genomic DNA (6Lund J. Sato A. Akira S. Medzhitov R. Iwasaki A. J. Exp. Med. 2003; 198: 513-520Crossref PubMed Scopus (1009) Google Scholar) specifically stimulate TLR9 (7Diebold S.S. Kaisho T. Hemmi H. Akira S. Reis E.S.C. Science. 2004; 303: 1529-1531Crossref PubMed Scopus (2739) Google Scholar, 8Heil F. Hemmi H Hochrein H Ampenberger F Kirschning C Akira S. Lipford G. Wagner H. Bauer S. Science. 2004; 303: 1526-1529Crossref PubMed Scopus (3062) Google Scholar), TLR7 is activated by infections with single-stranded RNA viruses, including influenza virus and vesicular stomatitis virus (VSV) (7Diebold S.S. Kaisho T. Hemmi H. Akira S. Reis E.S.C. Science. 2004; 303: 1529-1531Crossref PubMed Scopus (2739) Google Scholar, 9Lund J.M. Alexopoulou L. Sato A. Karow M. Adams N.C. Gale N.W. Iwasaki A. Flavell R.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 5598-5603Crossref PubMed Scopus (1497) Google Scholar). Consequently, plasmacytoid dendritic cells (pDCs) from TLR7-deficient mice fail to produce type I IFNs upon infection with influenza virus or VSV (7Diebold S.S. Kaisho T. Hemmi H. Akira S. Reis E.S.C. Science. 2004; 303: 1529-1531Crossref PubMed Scopus (2739) Google Scholar, 10Hemmi H. Kaisho T. Takeuchi O. Sato S. Sanjo H. Hoshino K. Horiuchi T. Tomizawa H. Takeda K. Akira S. Nat. Immunol. 2002; 3: 196-200Crossref PubMed Scopus (2072) Google Scholar). In addition to single-stranded RNA, the synthetic imidazoquinoline, imiquimod, a low molecular weight immune response modifier, activates TLR7 in both humans and mice, whereas its derivative resiquimod (R-848) activates TLR7 and TLR8 in humans but only TLR7 in mice (10Hemmi H. Kaisho T. Takeuchi O. Sato S. Sanjo H. Hoshino K. Horiuchi T. Tomizawa H. Takeda K. Akira S. Nat. Immunol. 2002; 3: 196-200Crossref PubMed Scopus (2072) Google Scholar, 11Jurk M. Heil F Vollmer J Schetter C. Krieg A.M. Wagner H. Lipford G. Bauer S. Nat. Immunol. 2002; 3: 499Crossref PubMed Scopus (817) Google Scholar). Both imiquimod and R-848 elicit robust anti-viral and anti-tumor immune responses in vivo, which correlate with a strong induction of type I IFNs (12Testerman T.L. Gerster J.F. Imbertson L.M. Reiter M.J. Miller R.L. Gibson S.J. Wagner T.L. Tomai M.A. J. Leukocyte Biol. 1995; 58: 365-372Crossref PubMed Scopus (254) Google Scholar, 13Stanley M.A. Clin. Exp. Dermatol. 2002; 27: 571-577Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 14Megyeri K. Au W.C. Rosztoczy I. Raj N.B. Miller R.L. Tomai M.A. Pitha P.M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 2207-2218Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). As a consequence of this activity, imiquimod is used for the treatment of external genital warts caused by human Papillomavirus (15von Krogh G. Eur. J. Dermatol. 2001; 11: 598-604PubMed Google Scholar). Interferon regulatory factors (IRFs) coordinate the expression of type I IFNs (16Juang Y.T. Lowther W. Kellum M. Au W.C. Lin R. Hiscott J. Pitha P.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 9837-9842Crossref PubMed Scopus (239) Google Scholar, 17Marie I. Durbin J.E. Levy D.E. EMBO J. 1998; 17: 6660-6669Crossref PubMed Google Scholar, 18Sato M. Suemori H. Hata N. Asagiri M. Ogasawara K. Nakao K. Nakaya T. Katsuki M. Noguchi S. Tanaka N. Taniguchi T. Immunity. 2000; 13: 539-548Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1096) Google Scholar, 19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar) as well as chemokines such as IP-10 and RANTES (regulated on activation normal T cell expressed and secreted) (20Lin R. Heylbroeck C. Genin P. Pitha P.M. Hiscott J. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 959-966Crossref PubMed Scopus (250) Google Scholar, 21Genin P. Algarte M. Roof P. Lin R. Hiscott J. J. Immunol. 2000; 164: 5352-5361Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar, 22Barnes B.J. Kellum M.J. Field A.E. Pitha P.M. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 5721-5740Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar). Viral infections, dsRNA, or LPS signaling can activate IRF3 and IRF7 (23Fitzgerald K.A. Rowe D.C. Barnes B.J. Caffrey D.R. Visintin A. Latz E. Monks B. Pitha P.M. Golenbock D.T. J. Exp. Med. 2003; 198: 1043-1055Crossref PubMed Scopus (932) Google Scholar, 24Kawai T. Takeuchi O. Fujita T. Inoue J. Muhlradt P.F. Sato S. Hoshino K. Akira S. J. Immunol. 2001; 167: 5887-5894Crossref PubMed Scopus (899) Google Scholar, 25Doyle S. Vaidya S. O'Connell R. Dadgostar H. Dempsey P. Wu T. Rao G. Sun R. Haberland M. Modlin R. Cheng G. Immunity. 2002; 17: 251-263Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (732) Google Scholar). In contrast, the activation of IRF5, another member of the IRF family, is much more restricted. Only certain viruses, including Newcastle disease virus (NDV), VSV, and herpes simplex virus type 1, have been shown to activate IRF5 (22Barnes B.J. Kellum M.J. Field A.E. Pitha P.M. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 5721-5740Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar), whereas Sendai virus (SeV) and dsRNA poly(I) poly(C) (pI:C), which activate IRF3 and IRF7, do not activate IRF5 (22Barnes B.J. Kellum M.J. Field A.E. Pitha P.M. Mol. Cell. Biol. 2002; 22: 5721-5740Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar). These observations suggest that IRF5 is activated by distinct signaling mechanisms to those regulating IRF3. In unstimulated cells IRFs reside in the cytoplasm. The activation of these factors requires phosphorylation on the C terminus, leading to dimerization, nuclear translocation, and binding to promoters containing IRF binding elements (26Barnes B. Lubyova B. Pitha P.M. J. Interferon Cytokine Res. 2002; 22: 59-71Crossref PubMed Scopus (273) Google Scholar, 27Yoneyama M. Suhara W. Fujita T. J. Interferon Cytokine Res. 2002; 22: 73-76Crossref PubMed Scopus (135) Google Scholar, 28Reich N.C. J. Interferon Cytokine Res. 2002; 22: 103-109Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar). The IKK-related kinases, IκB kinase ϵ (IKKϵ (also called IKKi) (29Peters R.T. Liao S.M. Maniatis T. Mol. Cell. 2000; 5: 513-522Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (281) Google Scholar, 30Shimada T. Kawai T. Takeda K. Matsumoto M. Inoue J. Tatsumi Y. Kanamaru A. Akira S. Int. Immunol. 1999; 11: 1357-1362Crossref PubMed Scopus (311) Google Scholar)) and TANK binding kinase 1 (TBK1 (also called T2K or NAK) (31Pomerantz J.L. Baltimore D. EMBO J. 1999; 18: 6694-6704Crossref PubMed Google Scholar, 32Bonnard M. Mirtsos C. Suzuki S. Graham K. Huang J. Ng M. Itie A. Wakeham A. Shahinian A. Henzel W.J. Elia A.J. Shillinglaw W. Mak T.W. Cao Z. Yeh W.C. EMBO J. 2000; 19: 4976-4985Crossref PubMed Google Scholar, 33Tojima Y. Fujimoto A. Delhase M. Chen Y. Hatakeyama S. Nakayama K. Kaneko Y. Nimura Y. Motoyama N. Ikeda K. Karin M. Nakanishi M. Nature. 2000; 404: 778-782Crossref PubMed Scopus (316) Google Scholar)) can directly phosphorylate IRF3 and IRF7 at the C terminus and control the expression of type I IFNs in response to SeV infection and TLR3 or TLR4 stimulation (34Sharma S. tenOever B.R. Grandvaux N. Zhou G.P. Lin R. Hiscott J. Science. 2003; 300: 1148-1151Crossref PubMed Scopus (1366) Google Scholar, 35Fitzgerald K.A. McWhirter S.M. Faia K.L. Rowe D.C. Latz E. Golenbock D.T. Coyle A.J. Liao S.M. Maniatis T. Nat. Immunol. 2003; 4: 491-496Crossref PubMed Scopus (2085) Google Scholar, 36McWhirter S.M. Fitzgerald K.A. Rosains J. Rowe D.C. Golenbock D.T. Maniatis T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 233-238Crossref PubMed Scopus (451) Google Scholar). The role of these two non-canonical IKKs in the regulation of IFN gene expression resulting from TLR7, TLR8, or TLR9 ligation or their ability to phosphorylate IRF5 has not yet been addressed. TLR3 and TLR4 are known to induce IFNB gene expression. This induction requires IRF3 and/or IRF7. TLR3 recruits the TIR domain containing adapter-inducing IFNβ, TRIF (37Yamamoto M. Sato S. Mori K. Hoshino K. Takeuchi O. Takeda K. Akira S. J. Immunol. 2002; 169: 6668-6672Crossref PubMed Scopus (1022) Google Scholar, 38Oshiumi H. Matsumoto M. Funami K. Akazawa T. Seya T. Nat. Immunol. 2003; 4: 161-167Crossref PubMed Scopus (1011) Google Scholar, 39Yamamoto M. Sato S. Hemmi H. Hoshino K. Kaisho T. Sanjo H. Takeuchi O. Sugiyama M. Okabe M. Takeda K. Akira S. Science. 2003; 301: 640-643Crossref PubMed Scopus (2510) Google Scholar), whereas TLR4 signaling utilizes TRIF and the adapter molecule, TRIF-related adapter molecule, TRAM (23Fitzgerald K.A. Rowe D.C. Barnes B.J. Caffrey D.R. Visintin A. Latz E. Monks B. Pitha P.M. Golenbock D.T. J. Exp. Med. 2003; 198: 1043-1055Crossref PubMed Scopus (932) Google Scholar, 40Yamamoto M. Sato S. Hemmi H. Uematsu S. Hoshino K. Kaisho T. Takeuchi O. Takeda K. Akira S. Nat. Immunol. 2003; 11: 1144-1150Crossref Scopus (827) Google Scholar). The adapter molecules MyD88 and Mal/TIRAP are not involved in type I IFN induction by the TLR3 or TLR4 signaling pathway. In contrast, studies with MyD88-deficient mice revealed that TLR7 and TLR9 signaling to IFNα is dependent on MyD88 (10Hemmi H. Kaisho T. Takeuchi O. Sato S. Sanjo H. Hoshino K. Horiuchi T. Tomizawa H. Takeda K. Akira S. Nat. Immunol. 2002; 3: 196-200Crossref PubMed Scopus (2072) Google Scholar, 41Krug A. French A.R. Barchet W. Fischer J.A. Dzionek A. Pingel J.T. Orihuela M.M. Akira S. Yokoyama W.M. Colonna M. Immunity. 2004; 21: 107-119Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (605) Google Scholar). Unlike IRF3, which is expressed constitutively in all cell types, the expression of IRF5 and IRF7 is restricted to B cells and dendritic cells, although their expression is inducible in other cell types by type I IFNs (19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar, 42Izaguirre A. Barnes B.J. Amrute S. Yeow W.S. Megjugorac N. Dai J. Feng D. Chung E. Pitha P.M. Fitzgerald-Bocarsly P. J. Leukocyte Biol. 2003; 74: 1125-1138Crossref PubMed Scopus (288) Google Scholar). The predominant source of type I IFNs in human blood is the pDC. pDCs release large amounts of type I IFN upon viral infection or stimulation with either R-848 or CpG DNA (43Gibson S.J. Lindh J.M. Riter T.R. Gleason R.M. Rogers L.M. Fuller A.E. Oesterich J.L. Gorden K.B. Qiu X. McKane S.W. Noelle R.J. Miller R.L. Kedl R.M. Fitzgerald-Bocarsly P. Tomai M.A. Vasilakos J.P. Cell. Immunol. 2002; 218: 74-86Crossref PubMed Scopus (342) Google Scholar, 44Siegal F.P. Kadowaki N. Shodell M. Fitzgerald-Bocarsly P.A. Shah K. Ho S. Antonenko S. Liu Y.J. Science. 1999; 284: 1835-1837Crossref PubMed Scopus (1902) Google Scholar). Consistent with these observations, pDCs express high levels of TLR7 and TLR9, whereas the expression of other TLRs is either very low or absent (45Jarrossay D. Napolitani G. Colonna M. Sallusto F. Lanzavecchia A. Eur. J. Immunol. 2001; 31: 3388-3393Crossref PubMed Scopus (669) Google Scholar, 46Kadowaki N. Ho S. Antonenko S. Malefyt R.W. Kastelein R.A. Bazan F. Liu Y.J. J. Exp. Med. 2001; 194: 863-869Crossref PubMed Scopus (1683) Google Scholar). The molecular mechanisms responsible for the induction of IFNs by TLR7, TLR8, and TLR9 signaling are unclear at present. Because pDCs express high constitutive levels of IRF5 as well as IRF7, we were prompted to investigate the functional importance of these two IRFs in the regulation of type I IFNs by these TLRs. We focused the present study on the TLR7 and TLR8 signaling pathway. We demonstrate that TLR7 and TLR8 activate both IRF5 and IRF7 and do not appear to activate IRF3. We also show using reconstitution experiments and siRNA silencing approaches that IRF5 is a critical mediator of TLR7 signaling. Both IRF5 and IRF7 are regulated in a MyD88-, IRAK1-, and TRAF6-dependent manner, in contrast to IRF3, which is regulated via TRIF in TLR3 or TLR4 signaling. Reagents—pFLAG-CMV1-TLR3 was cloned by PCR from a full-length cDNA clone. pFLAG-CMV1-TLR7 was cloned by PCR from THP-1 genomic DNA. The plasmid pcDNA3.1-TLR8 was a gift from the Eisai Research Institute (Andover, MA). Dominant negative IRF5 (DN IRF5) is a DNA binding domain deletion mutant of wild type IRF5 (variant 3, GenBank™ accession number AY504946) and is missing the first N-terminal 137 amino acids. The pcDNA3-MyD88-TIR-AU1 dominant negative (DN) plasmid was generated as described (47Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (984) Google Scholar). The Gal4 upstream activation sequence (UAS(GAL))-driven luciferase reporter gene and Gal4-IRF3 were from T. Fujita (Tokyo, Japan (48Yoneyama M. Suhara W. Fukuhara Y. Fukuda M. Nishida E. Fujita T. EMBO J. 1998; 17: 1087-1095Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar)). Gal4-IRF5 (19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar), Gal4-IRF7 (49Au W.C. Moore P.A. LaFleur D.W. Tombal B. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29210-29217Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar), FLAG-IRF5 (19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar), IRF7-GFP, and IRF5-GFP (19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar) were described previously. The IFNA1 and IFNB-secreted alkaline phosphatase reporter plasmids were as described (50Dent C.L. Gewert D.R. Eur. J. Biochem. 1996; 236: 895-903Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). TRAF2 and TRAF6 mutant constructs were from H. Wesche (Tularik, CA) (51Cao Z. Xiong J. Takeuchi M. Kurama T. Goeddel D.V. Nature. 1996; 383: 443-446Crossref PubMed Scopus (1122) Google Scholar). pI:C was from Amersham Biosciences. Resiquimod (R-848) was from GLSynthesis Inc. (Worcester, MA). SeV (Cantrell strain) and NDV (VR-699) were purchased from American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). VSV was from Phil Marcus (Connecticut, CT). The IRAK1-deficient I1A-HEK293 cells were form X. Li (Cleveland, OH) (52Li X. Commane M. Burns C. Vithalani K. Cao Z. Stark G.R. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 4643-4652Crossref PubMed Scopus (187) Google Scholar). Primary human fibroblasts and bovine kidney cells (Madin-Darby bovine kidney) were from Gary Hayward (Baltimore, MD). Reporter Gene Assays—HEK293 cells or I1A-HEK293 cells (0.2 × 105 cells per well of a 96-well plate) were transfected with 10 ng of pFLAG-CMV1-TLR7, pcDNA3.1-TLR8, pFLAG-CMV1-TLR3, or empty vector control and co-transfected with 40 ng of Gal4-IRF5 (variant 3), Gal4-IRF7, or Gal4-DBD plus 40 ng of the UAS(GAL)-luciferase reporter gene. Cells were additionally co-transfected with dominant negative constructs for MyD88 (MyD88 TIR), TBK1 (TBK1 K38A), IKKϵ (IKKϵ K38A), TRAF2 (DN TRAF2), or TRAF6 (DN TRAF6) as indicated. In all cases 40 ng per well of the thymidine kinase driven Renilla luciferase reporter gene (Promega, Madison, WI) was co-transfected to normalize for transfection efficiency. After 24 or 36 h of transfection, cells were stimulated for 8 or 15 h as indicated. Post-stimulation, cell lysates were prepared, and reporter gene activity was measured using the dual luciferase assay system (Promega). 5 × 105 2fTGH cells were plated in six-well plates and transfected for 20 h with 1 μg of IFNA1 or IFNB-secreted alkaline phosphatase reporter, 500 ng of pFLAG-CMV1-TLR7, and/or 1 μg FLAG-IRF5 and/or 500 ng DN IRF5 using Superfect transfection reagent (Qiagen, Santa Clarita, CA). Additionally, cells were transfected with 50 ng of the β-galactosidase expression plasmid to allow for the normalization of the data. 20 h after transfection cells were divided and seeded into 24-well plates and stimulated with 10 μm R-848 or infected with NDV (240 hemagglutination units; 1 hemagglutinin unit is defined as the amount of virus needed to agglutinate an equal volume of standardized red blood cell suspension) or VSV (multiplicity of infection 2) for an additional 16 h. The secreted alkaline phosphatase activity was determined as described (50Dent C.L. Gewert D.R. Eur. J. Biochem. 1996; 236: 895-903Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). All data are expressed as the mean relative stimulation ± S.D. All of the experiments described were performed a minimum of three occasions and gave similar results. Confocal Microscopy—RAW 264.7 cells (1 × 106) were transiently transfected with 2 μg of IRF5-GFP or IRF7-GFP using GeneJuice (Novagen, Madison, WI) to analyze the nuclear translocation of IRF5 or IRF7 visually. After 48 h of transfection, cells were stimulated for an additional 24 h with 15 μm R-848 or 100 μg/ml pI:C or phosphate-buffered saline. The analysis of nuclear translocation was performed using a Leica TCS SP2 AOBS confocal microscope. Type I IFN Bioassay—HEK293T, HEK293T/IRF5, 2fTGH, and 2fTGH/IRF5 cells (0.75 × 104 cells per well of a 96-well plate) were transiently transfected with 50 ng of pFLAG-CMV1-TLR7. 24 h later cells were stimulated with 10 μm R-848 or left untreated. THP-1 cells (1 × 106) were stimulated with 10 μm R-848 or infected with NDV (240 hemagglutination units) or VSV (multiplicity of infection 2) or left untreated. The levels of biologically active type I IFNs were determined in the cell culture supernatant after 16 h of stimulation by the viral cytopathic effect assay (53Yeh T.J. McBride P.T. Overall Jr., J.C. Green J.A. J. Clin. Microbiol. 1982; 16: 413-415Crossref PubMed Google Scholar). Vesicular stomatitis virus was used as the challenging virus, and the cytopathic effect was determined in human fibroblasts and/or Madin-Darby bovine kidney cells. RNA Interference—The coding region of IRF5 was targeted with the following IRF5 siRNA: 5′-ATACACCGAAGGCGTGGAT-3′ (Dharmacon Inc., Lafayette, CO). The conditions for IRF5 gene silencing were determined by transfecting 2fTGH/FLAG-IRF5 cells with 0, 2, 5, 7, or 10 nm IRF5 siRNA, a scrambled siRNA control, or a LacZ siRNA control (sequence 5′-AACGTACGCGGAATACTTCGA-3′) using Mirus TransIT® TKO reagent (Mirus, Madison, WI). The efficiency of IRF5 silencing was analyzed after 24 h of transfection by reverse transcription-PCR and/or immunoblot. Amaxa Electroporation of Suspension Cells—THP-1 cells were electroporated using the Amaxa kit (Gaithersburg, MD) according to manufacturer's specifications. Briefly, THP-1 cells (1 × 106) were harvested and resuspended in 100 μl of Nucleofector solution. After the addition of IRF5 siRNA (7 nm) or LacZ siRNA (10 nm), cells were electroporated using Amaxa program U-01 or V-01. 8 h after transfection, cells were exposed to 10 μm R-848 or left untreated. After an additional 16 h cells were subjected to reverse transcription-PCR analysis. Reverse Transcription-PCR Analysis—RNA was isolated from 1 × 106 THP-1 cells using an RNeasy Mini Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA). One microgram of DNase-treated total RNA was reverse-transcribed to cDNA with oligo(dT) primers in a 20-μl reaction. Human IFNα (consensus primers designed to recognize most human IFNα subtypes), IFNβ, IRF5, and β-actin cDNA were amplified by PCR using primers and PCR conditions as previously described (42Izaguirre A. Barnes B.J. Amrute S. Yeow W.S. Megjugorac N. Dai J. Feng D. Chung E. Pitha P.M. Fitzgerald-Bocarsly P. J. Leukocyte Biol. 2003; 74: 1125-1138Crossref PubMed Scopus (288) Google Scholar, 54Yeow W.S. Au W.C. Juang Y.T. Fields C.D. Dent C.L. Gewert D.R. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2000; 275: 6313-6320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (89) Google Scholar). Recombinant Proteins—GST fusion proteins and baculovirus proteins were prepared as described (55Lee F.S. Peters R.T. Dang L.C. Maniatis T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 9319-9324Crossref PubMed Scopus (356) Google Scholar). Kinase Assays—In vitro kinase assays were performed as described (55Lee F.S. Peters R.T. Dang L.C. Maniatis T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 9319-9324Crossref PubMed Scopus (356) Google Scholar) using 10 ng of recombinant IKKβ or TBK1 and 1 μg of GST-IRF3, IRF5, IκBα wild type, and IκBα S32/36A. TLR7 and TLR8 Activate IRF5 and IRF7 but Not IRF3— Double-stranded RNA and LPS induce type I IFN gene expression via the adapter molecule TRIF and the transcriptional regulator IRF3 (37Yamamoto M. Sato S. Mori K. Hoshino K. Takeuchi O. Takeda K. Akira S. J. Immunol. 2002; 169: 6668-6672Crossref PubMed Scopus (1022) Google Scholar, 38Oshiumi H. Matsumoto M. Funami K. Akazawa T. Seya T. Nat. Immunol. 2003; 4: 161-167Crossref PubMed Scopus (1011) Google Scholar, 39Yamamoto M. Sato S. Hemmi H. Hoshino K. Kaisho T. Sanjo H. Takeuchi O. Sugiyama M. Okabe M. Takeda K. Akira S. Science. 2003; 301: 640-643Crossref PubMed Scopus (2510) Google Scholar). The molecular mechanisms responsible for the induction of type I IFNs in TLR7 or TLR8 signaling is unclear at present. We were interested in elucidating the role of the transcription factors IRF3, IRF5, and IRF7 in signaling by TLR7 and TLR8. To this end we monitor the activation of these factors individually. We employed an in vivo reporter assay that utilizes hybrid proteins consisting of the yeast Gal4 DNA binding domain fused either to IRF3, IRF5, or IRF7, lacking its own DNA binding domain (19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar, 49Au W.C. Moore P.A. LaFleur D.W. Tombal B. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29210-29217Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar, 56Wathelet M.G. Lin C.H. Parekh B.S. Ronco L.V. Howley P.M. Maniatis T. Mol. Cell. 1998; 1: 507-518Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (654) Google Scholar). In this assay the UAS(GAL)-driven luciferase reporter gene expression requires activation of the corresponding IRF fusion protein (56Wathelet M.G. Lin C.H. Parekh B.S. Ronco L.V. Howley P.M. Maniatis T. Mol. Cell. 1998; 1: 507-518Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (654) Google Scholar). The basal level of all three IRF fusion proteins was similar in untreated cells. TLR7- or TLR8-expressing HEK293 cells transfected with Gal4-IRF3, Gal4-IRF5, or Gal4-IRF7 plasmids were stimulated with R-848. TLR7 or -8 signaling activated IRF5 and IRF7 but not IRF3 (Fig. 1A, upper panel). Stimulation of TLR3-expressing HEK293 with pI:C did not activate IRF5 (Fig. 1A, bottom left panel), although IRF3 and IRF7 were induced in a robust manner. Furthermore, infection of HEK293 cells with SeV, a well characterized activator of IRF3 and IRF7, also failed to activate IRF5 (Fig. 1A, bottom right panel), in agreement with published reports (19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar). Thus, TLR7 and TLR8 activate IRF5 and IRF7 and do not appear to activate IRF3. Neither Sendai virus nor TLR3 signaling activated IRF5. As a second independent methodology, we examined the nuclear translocation of these three IRFs in RAW264.7 macrophage-like cells transfected with IRFGFP fusion constructs. The IRF5-GFP or IRF7-GFP fusion proteins were expressed in the cytoplasm of unstimulated cells (Fig. 1, B and C). Stimulation of these cells with R-848 resulted in the nuclear translocation of both IRF5-GFP and IRF7-GFP (Fig. 1, B and C, middle panels) but did not induce nuclear translocation of IRF3-GFP (data not shown). In agreement with the Gal4-IRF5 assay, IRF5-GFP did not translocate to the nucleus in cells stimulated with pI:C (Fig. 1B, lower panel). IRF7-GFP did, however, translocate in response to pI:C, in agreement with previous reports (Fig. 1C, lower panel). These nuclear translocation data are representative of several fields analyzed. We also looked at IRF3 phosphorylation using phospho-specific IRF3 antibodies in R-848- and LPS-stimulated cells. There was no detectable phosphorylation of IRF3 with R-848 seen (data not shown), in contrast to LPS, which did induce IRF3 phosphorylation. Taken together, these observations establish that unlike TLR3, TLR7 and TLR8 can activate IRF5 but not IRF3. Consistent with these observations, R-848 did not induce IRF3-DNA binding activity to an ISG-15 probe (which binds activated IRF3) under conditions where NF-κB was activated (data not shown), further supporting the idea that IRF3 is not a mediator of the TLR7 signaling pathway. While this manuscript was in preparation, two independent reports from the Akira and Taniguchi laboratories (57Kawai T. Sato S. Ishii K.J. Coban C. Hemmi H. Yamamoto M. Terai K. Matsuda M. Inoue J. Uematsu S. Takeuchi O. Akira S. Nat. Immunol. 2004; 5: 1061-1068Crossref PubMed Scopus (831) Google Scholar, 58Honda K. Yanai H. Mizutani T. Negishi H. Shimada N. Suzuki N. Ohba Y. Takaoka A. Yeh W.C. Taniguchi T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 15416-15421Crossref PubMed Scopus (428) Google Scholar) demonstrated that IRF3 was not activated in either the TLR7 or TLR9 signaling pathway. TLR7 Can Induce Type I IFNs via IRF5—IRF5 and IRF7 have been shown to regulate the expression of overlapping as well as distinct IFNα subsets, which are encoded by at least 13 IFNA genes in humans (17Marie I. Durbin J.E. Levy D.E. EMBO J. 1998; 17: 6660-6669Crossref PubMed Google Scholar, 19Barnes B.J. Moore P.A. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2001; 276: 23382-23390Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar, 49Au W.C. Moore P.A. LaFleur D.W. Tombal B. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 29210-29217Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar, 54Yeow W.S. Au W.C. Juang Y.T. Fields C.D. Dent C.L. Gewert D.R. Pitha P.M. J. Biol. Chem. 2000; 275: 6313-6320Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (89) Google Scholar). IRF3 alone is sufficient for the induction of IFNβ (16Juang Y.T. Lowther W. Kellum M. Au W.C. Lin R. Hiscott J. Pitha P.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 9837-9842Crossref PubMed Scopus (239) Google Scholar, 18Sato M. Suemori H. Hata N. Asagiri M. Ogasawara K. Nakao K. Nakaya T. Katsuki M. Noguchi S. Tanaka N. Taniguchi T. Immunity. 2000; 13: 539-548Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1096) G

Abstract Metastasis is driven by extensive cooperation between a tumor and its microenvironment, resulting in the adaptation of molecular mechanisms that evade the immune system and enable pre-metastatic niche (PMN) formation. Little is known of the tumor-intrinsic factors that regulate these mechanisms. Here we show that expression of the transcription factor interferon regulatory factor 5 (IRF5) in osteosarcoma (OS) and breast carcinoma (BC) clinically correlates with prolonged survival and decreased secretion of tumor-derived extracellular vesicles (t-dEVs). Conversely, loss of intra-tumoral IRF5 establishes a PMN that supports metastasis. Mechanistically, IRF5-positive tumor cells retain IRF5 transcripts within t-dEVs that contribute to altered composition, secretion, and trafficking of t-dEVs to sites of metastasis. Upon whole-body pre-conditioning with t-dEVs from IRF5-high or -low OS and BC cells, we found increased lung metastatic colonization that replicated findings from orthotopically implanted cancer cells. Collectively, our findings uncover a new role for IRF5 in cancer metastasis through its regulation of t-dEV programming of the PMN.

Despite the progress made in identifying cellular factors and mechanisms that predict progression and metastasis, breast cancer remains the second leading cause of death for women in the US. Using The Cancer Genome Atlas and mouse models of spontaneous and invasive mammary tumorigenesis, we identified that loss of function of interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a predictor of metastasis and survival. Histologic analysis of Irf5 -/- mammary glands revealed expansion of luminal and myoepithelial cells, loss of organized glandular structure, and altered terminal end budding and migration. RNA-seq and ChIP-seq analyses of primary mammary epithelial cells from Irf5 +/+ and Irf5 -/- littermate mice revealed IRF5-mediated transcriptional regulation of proteins involved in ribosomal biogenesis. Using an invasive model of breast cancer lacking Irf5 , we demonstrate that IRF5 re-expression inhibits tumor growth and metastasis via increased trafficking of tumor infiltrating lymphocytes and altered tumor cell protein synthesis. These findings uncover a new function for IRF5 in the regulation of mammary tumorigenesis and metastasis.Loss of IRF5 is a predictor of metastasis and survival in breast cancer.IRF5 contributes to the regulation of ribosome biogenesis in mammary epithelial cells.Loss of IRF5 function in mammary epithelial cells leads to increased protein translation.

Abstract Ribosomopathies are a class of disorders caused by defects in the structure or function of the ribosome and characterized by tissue-specific abnormalities. Diamond Blackfan anemia (DBA) arises from different mutations, predominantly in genes encoding ribosomal proteins (RPs). Apart from the anemia, skeletal defects are among the most common anomalies observed in patients with DBA, but they are virtually restricted to radial ray and other upper limb defects. What leads to these site-specific skeletal defects in DBA remains a mystery. Using a novel mouse model for RP haploinsufficiency, we observed specific, differential defects of the limbs. Using complementary in vitro and in vivo approaches, we demonstrate that reduced WNT signaling and subsequent increased β-catenin degradation in concert with increased expression of p53 contribute to mesenchymal lineage failure. We observed differential defects in the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from the forelimb versus the hind limbs of the RP haploinsufficient mice that persisted after birth and were partially rescued by allelic reduction of Trp53 . These defects are associated with a global decrease in protein translation in RP haploinsufficient MSCs, with the effect more pronounced in cells isolated from the forelimbs. Together these results demonstrate translational differences inherent to the MSC, explaining the site-specific skeletal defects observed in DBA.

Abstract Background Cancer-testis (CT) genes are targets for tumor antigen-specific immunotherapy given that their expression is normally restricted to the immune-privileged testis in healthy individuals with aberrant expression in tumor tissues. While they represent targetable germ-tissue antigens and play important functional roles in tumorigenesis, there is currently no standardized approach for identifying clinically relevant CT genes. Optimized algorithms and validated methods for accurate prediction of reliable CT antigens with high immunogenicity are also lacking. Methods Sequencing data from the Genotype-Tissue Expression (GTEx) and The Genomic Data Commons (GDC) databases was utilized for the development of a bioinformatic pipeline to identify CT exclusive genes. A CT germness score was calculated based on the number of CT genes expressed within a tumor type and their degree of expression. The impact of tumor germness with clinical outcome was evaluated using healthy GTEx and GDC tumor samples. We then used a triple-negative breast cancer mouse model to develop and test an algorithm that predicts epitope immunogenicity based on the identification of germline sequences with strong MHCI and MHCII binding affinities. Germline sequences for CT genes were synthesized as long synthetic peptide vaccines and tested in the 4T1 triple-negative model of invasive breast cancer with Poly(I:C) adjuvant. Vaccine immunogenicity was determined by flow cytometric analysis of in vitro and in vivo T cell responses. Primary tumor growth and lung metastasis was evaluated by histopathology, flow cytometry and colony formation assay. Results We developed a new bioinformatic pipeline to reliably identify CT exclusive genes as immunogenic targets for immunotherapy. We identified CT genes that are exclusively expressed within the testis, lack detectable thymic expression, and are significantly expressed in multiple tumor types. High tumor germness correlated with tumor progression but not with tumor mutation burden, supporting CT antigens as appealing targets in low mutation burden tumors. Importantly, tumor germness also correlated with markers of anti-tumor immunity. Vaccination of 4T1 tumor bearing mice with Siglece and Lin28a antigens resulted in increased T cell anti-tumor immunity and reduced primary tumor growth and lung metastases. Conclusion Our results present a novel strategy for the identification of highly immunogenic CT antigens for the development of targeted vaccines that induce anti-tumor immunity and inhibit metastasis.

Although dynamic alterations in transcriptional, translational, and metabolic programs have been described in T cells, the factors and pathways guiding these molecular shifts are poorly understood, with recent studies revealing a disassociation between transcriptional responses and protein expression following T cell receptor (TCR) stimulation. Previous studies identified interferon regulatory factor 5 (IRF5) in the transcriptional regulation of cytokines, chemotactic molecules and T effector transcription factors following TCR signaling. In this study, we identified T cell intrinsic IRF5 regulation of mTORC1 activity as a key modulator of CD40L protein expression. We further demonstrated a global shift in T cell metabolism, with alterations in glutamine metabolism accompanied by shifts in T cell populations at the single cell level due to loss of

 Anemia commonly occurs in systemic lupus erythematosus (SLE), a disease characterized by innate immune activation by nucleic acids. Overactivation of cytoplasmic sensors by self-DNA or RNA can cause erythroid cell death while sparing other hematopoietic cell lineages. However, little is currently known about the impact of nucleic acid sensing innate receptors on the bone marrow (BM) erythropoietic niche. The ssRNA endosomal receptors TLR7 and human TLR8 both recognize ssRNA. TLR7 overexpression causes a lupus syndrome that includes the development of mild to moderate anemia (Hb >10) and thrombocytopenia and is associated with spleen histiocytosis, autoimmune hemolysis, erythrophagocytosis and compensatory stress erythropoiesis in the spleen. A recent study demonstrated that patients with TLR8 gain of function present with immunodeficiency, inflammation and bone marrow failure. However, the role of TLR8 in SLE has been difficult to study in mice because it has a 5 amino acid deletion that attenuates its RNA binding capacity. To address the role of TLR8 in SLE, we overexpressed human TLR8 in a lupus mouse model (huTLR8tg.Sle1.Yaa) using a BAC transgene. 50% of homozygous huTLR8tg.Sle1.Yaa mice developed severe anemia (Hb < 9) resulting in early mortality starting at 3–4.5 months of age. This phenotype required both the Sle1 and Yaa loci that promote the formation of high titer anti-chromatin and anti-RNA antibodies and onset of nephritis at > 6 months of age. There was no difference in autoantibody titers between Sle1.Yaa wt and huTLR8tg mice and early death in the transgenic mice was not due to premature onset of renal disease. All mice had normal RBC indices prior to 10 weeks of age. Anemia was associated with an increase in bone marrow (BM) trabecular bone and a decrease in erythromyeloblastic islands (EMBI) in the BM with compensatory stress erythropoiesis leading to reticulocytosis and vast splenomegaly. RBC half- life decreased in severely anemic mice as a pre-terminal event and was due to hemophagocytosis by 3 subsets of phagocytic red pulp macrophages. Flow cytometry of BMs showed a block in CFU-E to proerythroblast differentiation that was confirmed by single cell RNASeq of bone marrow EMBIs. The erythroblast cluster proximal to the block had a signature of mitochondrial stress and decreased proliferation. We found 6 closely related clusters of EMBI central macrophages in the BM, most of which displayed an inflammatory and Type 1 IFN signature. One cluster (M2) expressed all the classical central macrophage phenotypic markers was characterized in transgenic mice by downregulation of multiple phagocytic receptors and a 5-fold decrease of VCAM1 expression. Loss of VCAM1 and downregulation of Mertk and CD169 in BM central macrophages was confirmed by flow cytometry. By contrast spleen central macrophages from transgenic mice retained VCAM1 and CD169 expression (figures 1–3). Together, these results suggest that erythropoiesis in the BM of huTLR8tg SLE-prone mice fails due to a block in differentiation from CFU-E to proerythroblasts in the BM and is associated with an inflammatory phenotype specifically in BM erythroblastic island central macrophages and down regulation of adhesion and phagocytic receptors. These data implicate the endosomal RNA sensor TLR8 as an additional innate receptor whose overactivation causes acquired failure of erythropoiesis via myeloid cell dysregulation. Compensatory stress erythropoiesis in the spleens is associated with expansion of several subsets of macrophages with phagocytic properties and fatal anemia is associated with a decrease in red blood cell half-life, suggesting that excessive RBC phagocytosis, coupled with insufficient erythroblast progenitors, eventually exceeds the capability of stress erythropoiesis to replace the RBC mass.