PIP3-dependent Rac exchanger 1 (P–Rex1) is abundantly expressed in neutrophils and plays central roles in chemotaxis and cancer metastasis by serving as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for Rac. The enzyme is synergistically activated by PIP3 and the heterotrimeric Gβγ subunits, but mechanistic details remain poorly understood. While investigating the regulation of P–Rex1 by PIP3, we discovered that Ins(1,3,4,5)P4 (IP4) inhibits P–Rex1 activity and induces large decreases in backbone dynamics in diverse regions of the protein. Cryo–electron microscopy analysis of the P–Rex1·IP4 complex revealed a conformation wherein the pleckstrin homology (PH) domain occludes the active site of the Dbl homology (DH) domain. This configuration is stabilized by interactions between the first DEP domain (DEP1) and the DH domain and between the PH domain and a 4–helix bundle (4HB) subdomain that extends from the C–terminal domain of P–Rex1. Disruption of the DH—DEP1 interface in a DH/PH–DEP1 fragment enhanced activity and led to a more extended conformation in solution, whereas mutations that constrain the occluded conformation led to decreased GEF activity. Variants of full–length P–Rex1 in which the DH—DEP1 and PH—4HB interfaces were disturbed exhibited enhanced activity during chemokine–induced cell migration, confirming that the observed structure represents the autoinhibited state in living cells. Interactions with PIP3–containing liposomes led to disruption of these interfaces and increased dynamics protein–wide. Our results further suggest that inositol phosphates such as IP4 help to inhibit basal P–Rex1 activity in neutrophils, similar to their inhibitory effects on phosphatidylinositol–3–kinase.

PIP 3 -dependent Rac exchanger 1 (P-Rex1) is abundantly expressed in neutrophils and plays central roles in chemotaxis and cancer metastasis by serving as a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for Rac. The enzyme is synergistically activated by PIP 3 and heterotrimeric Gβγ subunits, but mechanistic details remain poorly understood. While investigating the regulation of P-Rex1 by PIP 3 , we discovered that Ins(1,3,4,5)P 4 (IP 4 ) inhibits P-Rex1 activity and induces large decreases in backbone dynamics in diverse regions of the protein. Cryo-electron microscopy analysis of the P-Rex1·IP 4 complex revealed a conformation wherein the pleckstrin homology (PH) domain occludes the active site of the Dbl homology (DH) domain. This configuration is stabilized by interactions between the first DEP domain (DEP1) and the DH domain and between the PH domain and a 4-helix bundle (4HB) subdomain that extends from the C-terminal domain of P-Rex1. Disruption of the DH–DEP1 interface in a DH/PH-DEP1 fragment enhanced activity and led to a more extended conformation in solution, whereas mutations that constrain the occluded conformation led to decreased GEF activity. Variants of full-length P-Rex1 in which the DH–DEP1 and PH–4HB interfaces were disturbed exhibited enhanced activity during chemokine-induced cell migration, confirming that the observed structure represents the autoinhibited state in living cells. Interactions with PIP 3 -containing liposomes led to disruption of these interfaces and increased dynamics protein-wide. Our results further suggest that inositol phosphates such as IP 4 help to inhibit basal P-Rex1 activity in neutrophils, similar to their inhibitory effects on phosphatidylinositol-3-kinase.

Abstract The conversion of PIP2 to PIP3 by phosphoinositide 3-kinase γ (PI3Kγ) is a critical step in neutrophil chemotaxis and is essential for metastasis in many types of cancer. PI3Kγ is activated via directed interaction with Gβγ heterodimers released from cell-surface G protein-coupled receptors (GPCRs) responding to extracellular signals. To resolve how Gβγ activates PI3Kγ, we determined cryo-EM reconstructions of PI3Kγ–Gβγ complexes in the presence of various substrates/analogs, revealing two distinct Gβγ binding sites, one on the p110γ helical domain and one on the C-terminal domain of the p101 subunit. Comparison of these complexes with structures of PI3Kγ alone demonstrates conformational changes in the kinase domain upon Gβγ binding similar to those induced by Ras·GTP. Assays of variants perturbing the two Gβγ binding sites and interdomain contacts that change upon Gβγ binding suggest that Gβγ not only recruits the enzyme to membranes but also allosterically controls activity via both sites. Studies in a zebrafish model examining neutrophil migration are consistent with these results. These findings set the stage for future detailed investigation of Gβγ-mediated activation mechanisms in this enzyme family and will aid in developing drugs selective for PI3Kγ.