The rice blast resistance (R) genes Pi2 and Piz-t confer broad-spectrum resistance against different sets of Magnaporthe grisea isolates. We first identified the Pi2 gene using a map-based cloning strategy. The Pi2 gene is a member of a gene cluster comprising nine gene members (named Nbs1-Pi2 to Nbs9-Pi2) and encodes a protein with a nucleotide-binding site and leucine-rich repeat (LRR) domain. Fine genetic mapping, molecular characterization of the Pi2 susceptible mutants, and complementation tests indicated that Nbs4-Pi2 is the Pi2 gene. The Piz-t gene, a Pi2 allele in the rice cultivar Toride 1, was isolated based on the Pi2 sequence information. Complementation tests confirmed that the family member Nbs4-Piz-t is Piz-t. Sequence comparison revealed that only eight amino-acid changes, which are confined within three consecutive LRR, differentiate Piz-t from Pi2. Of the eight variants, only one locates within the xxLxLxx motif. A reciprocal exchange of the single amino acid between Pi2 and Piz-t did not convert the resistance specificity to each other but, rather, abolished the function of both resistance proteins. These results indicate that the single amino acid in the xxLxLxx motif may be critical for maintaining the recognition surface of Pi2 and Piz-t to their respective avirulence proteins.

Abstract Most Eukaryotic organisms produce nitric oxide (NO); however, the mechanisms underpinning NO’s biosynthesis are only known in animals. In animals, there seems to be a non-described additional system for producing NO in many cell types, including blood vessels where NO is essential for blood pressure control. NO is known to be a signalling molecule of the innate immunity system in plants and fungi although no NO generation has yet been described. In the plant pathogenic fungus Fusarium graminearum, we demonstrate an extra NO-producing system in fungi that seems also present in mammals and plants and, thus, likely the evolutionary original. The discovered NO-producing enzymes are already well-known sterol-producing enzymes with more than one function. Both these enzymes are targets for statins and the major fungicides; thus, the NO production of the new system has consequences for agriculture (pathogen resistance and control) and medicine (blood pressure control, immunity and sepsis).

Abstract Rice cultivars from japonica and indica lineage possess differential resistance against blast fungus on an account genetic divergence. Whether different rice cultivars also show distinct metabolomic changes in response to P. oryzae , and their role in host resistance, are poorly understood. Here, we examine the responses of six different rice cultivars from japonica and indica lineage challenged with P. oryzae . Both susceptible and resistant rice cultivars expressed several metabolites exclusively during P. oryzae infection, including the saponin Bayogenin 3-O-cellobioside. Bayogenin 3-O-cellobioside level in infected rice directly correlated with their resistant attributes. These findings reveal, for the first time to our knowledge that besides oat, other grass plants including rice produces protective saponins. Our study provides insight into the role of pathogen-mediated metabolomics-reprogramming in host immunity. The correlation between Bayogenin 3-O-Cellobioside levels and blast resistance suggests that engineering saponin expression in cereal crops represents an attractive and sustainable disease control strategy.

ABSTRACT Magnaporthe oryzae (Mo) is a model pathogen causing rice blast resulting in yield and economic losses world-wide. CK2 is a constitutively active, serine/threonine kinase in eukaryotes, having a wide array of known substrates and involved in many cellular processes. We investigated the localization and role of MoCK2 during growth and infection. BLAST search for MoCK2 components and targeted deletion of subunits was combined with protein-GFP fusions to investigate localization. We found one CKa and two CKb subunits of the CK2 holoenzyme. Deletion of the catalytic subunit CKa was not possible and might indicate that such deletions are lethal. The CKb subunits could be deleted but they were both necessary for normal growth and pathogenicity. Localization studies showed that the CK2 holoenzyme needed to be intact for normal localization at septal pores and at appressorium penetration pores. Nuclear localization of CKa was however not dependent on the intact CK2 holoenzyme. In appressoria, CK2 formed a large ring perpendicular to the penetration pore and the ring formation was dependent on the presence of all CK2 subunits. The effects on growth and pathogenicity of deletion of the b subunits combined with the localization indicate that CK2 can have important regulatory functions not only in the nucleus/nucleolus but also at fungal specific structures as septa and appressorial pores.

Abstract Arms race co-evolution of plant-pathogen interactions evolved sophisticated recognition mechanisms between host immune receptors and pathogen effectors. Different allelic haplotypes of an immune receptor in host mount distinct recognition against sequence or non-sequence related effectors in pathogens. We report the molecular characterization of the Piks allele of the rice immune receptor Pik against rice blast pathogen, which requires two head-to-head arrayed nucleotide binding site and leucine-rich repeat proteins. Like other Pik genes, both Piks -1 and Piks -2 are necessary and sufficient for Piks -mediated resistance. However, unlike other Pik alleles, Piks does not recognize any known AvrPik variants of M. oryzae . Sequence analysis of the genome of an avirulent isolate V86010 further revealed that its cognate avirulence ( Avr ) gene most likely has no significant sequence similarity to known AvrPik variants. We conclude that Piks breaks the canonical Pik / AvrPik recognition pattern. Piks -1 and Pikm -1 have only two amino acid differences within the integrated heavy metal-associated (HMA) domain. Pikm-1-HMA interact with AvrPik-A, -D and -E in vitro and in vivo , whereas Piks-1-HMA does not bind any AvrPik variants. Reciprocal exchanges of single amino acid residues between Piks-1 and Pikm-1 further reveal a dynamic recognition mechanism between Piks/Pikm alleles and their respective effectors. Piks-1 E229Q /Pikm-1 V261A can only activate immunity to AvrPik-D but not to other effectors, indicating that the amino acid change of E to Q at position 229 leads to its gain of a partial recognition spectrum of Pikm . By contrast, Piks -1 A261V / Pikm -1 Q229E confers immunity to the Piks cognate effector, indicating that the amino acid change of Q to E at position 229 leads to its shifts of the recognition from Pikm to Piks . Intriguingly, binding activities in both Y2H and analytical gel filtration assays are illustrated between Piks-1 A261V /Pikm-1 Q229E and AvrPik-D. However, it is unable to mount immunity against AvrPik-D , suggesting that biochemical activities based on in vitro and in vivo assays could be insufficient for sustaining biological function of receptor and effector pairs.

Abstract Isw2 proteins are conserved in eukaryotes and are known to bind to DNA and dynamically influence local chromosome condensation close to their DNA binding site in an ATP-dependent manner making genes close to the binding sites more accessible for transcription and repression. A putative MoISW2 gene was deleted with large effects on plant pathogenicity as a result. The gene was complemented and a ChIP-sec was performed to identify binding sites. RNAsec showed effects on the overall regulation of genes along the chromosomes for mutant and background strains and this was compared with RNAseq from 55 downloaded RNA-seq datasets from the same strain and found similar. MoIsw2 binding and activities create genomic regions affected by MoIsw2 with high gene expression variability close to the MoIsw2 binding sites while surrounding regions have lower gene expression variability. The genes affected by the MoIsw2 activity are niche-determinant genes (secreted proteins, secondary metabolites and stress-coping genes) and avirulence genes. We further show that MoIsw2 binding sites with the DNA binding motifs coincide with known transposable elements (TE) making it likely that TE-transposition at the binding sites can affect the transcription profile of M. oryze in a strain-specific manner. We conclude that MoIsw2 is a likely candidate for a master regulator, regulating the dynamic balance between biomass growth genes (like housekeeping genes) and nich-determinant genes important for ecological fitness. Stress-induced TE transposition is together with MoIsw2 activity a likely mechanism creating more mutations and faster evolution of the niche-determinant genes than for housekeeping genes.

Abstract Peroxisomes are ubiquitous organelles in eukaryotic cells that fulfill various important metabolic functions. In this study, we investigated the role of Docking/Translocation Module (DTM) peroxins, mainly FvPex8, FvPex13, FvPex14, and FvPex33, in Fusarium verticillioides virulence and fumonisin B1 (FB1) biosynthesis. Protein interaction experiments suggested that FvPex13 serves as the core subunit of F. verticillioides DTM. When we generated gene deletion mutants (ΔFvpex8, ΔFvpex13, ΔFvpex14, ΔFvpex33, ΔFvpex33/14) and examined whether the expression of other peroxin genes were affected in the DTM mutants, ΔFvpex8 strain showed most drastic changes to PEX gene expression profiles. Deletion mutants exhibited disparity in carbon source utilization and defect in cell wall integrity when stress agents were applied. Under nutrient starvation, mutants also showed higher levels of lipid droplet accumulation. Notably, ΔFvpex8 mutant showed significant FB1 reduction and altered expression of FUM1 and FUM19 genes. However, FvPex13 was primarily responsible for virulence, while ΔFvpex33/14 double mutant also showed virulence defect. In summary, our study suggests that FvPex13 is the core component of DTM, regulating peroxisome membrane biogenesis as well as PTS1- and PTS2-mediated transmembrane cargo transportation. Importantly, we predict FvPex8 as a key component in DTM that affects peroxisome function in FB1 biosynthesis in F. verticillioides .

ABSTRACT Dynamic transposition of transposable elements (TEs) in fungal pathogens have significant impact on genome stability, gene expression, and virulence to the host. In Magnaporthe oryzae , genome plasticity resulting from TE insertion is a major driving force leading to the rapid evolution and diversification of this fungus. Despite their importance in M. oryzae population evolution and divergence, our understanding of TEs in this context remains limited. Here we conducted a genome-wide analysis of TE transposition dynamics in the 11 most abundant TE families in M. oryzae populations. Our results show that these TEs have specifically expanded in recently isolated M. oryzae rice populations, with the presence/absence polymorphism of TE insertions highly concordant with population divergence on Geng/ Japonica and Xian/ Indica rice cultivars. Notably, the genes targeted by clade-specific TEs showed clade-specific expression patterns and are involved in the pathogenic process, suggesting a transcriptional regulation of TEs on targeted genes. Our study provides a comprehensive analysis of TEs in M. oryzae populations and demonstrates a crucial role of recent TE bursts in adaptive evolution and diversification of the M. oryzae rice-infecting lineage. IMPORTANCE M. oryzae is the causal agent of the destructive blast disease, which caused massive loss of yield annually worldwide. The fungus diverged into distinct clades during adaptation toward two rice subspecies, Xian/indica and Geng/japonica. Although the role of TEs in the adaptive evolution was well established, mechanisms underlying how TEs promote the population divergence of M. oryzae remains largely unknown. In this study, we reported that TEs shape the population divergence of M. oryzae by differentially regulating gene expression between Xian/ Indica -infecting and Geng/ Japonica -infecting populations. Our results revealed a TE insertion mediated gene expression adaption that led to the divergence of M. oryzae population infecting different rice subspecies.

Backgrounds: Pyricularia is a multispecies complex that could infect and cause severe blast disease on diverse hosts, including rice, wheat and many other grasses. Although the genome size of this fungal complex is small [~40 Mbp for Pyricularia oryzae (syn. Magnaporthe oryzae), and ~45 Mbp for P. grisea], the genome plasticity allows the fungus to jump and adapt to new hosts. Therefore, deciphering the genome basis of individual species could facilitate the evolutionary and genetic study of this fungus. However, except for the P. oryzae subgroup, many other species isolated from diverse hosts, such as the Pennisetum grasses, remain largely uncovered genetically. Results: Here, we report the genome sequence of a pyriform-shaped fungal strain P. penniseti P1609 isolated from a Pennisetum grass (JUJUNCAO) using PacBio SMRT sequencing technology. We performed a phylogenomic analysis of 28 Magnaporthales species and 5 non-Magnaporthales species and addressed P1609 into a Pyricularia subclade that is distant from P. oryzae. Comparative genomic analysis revealed that the pathogenicity-related gene repertoires were fairly different between P1609 and the P. oryzae strain 70-15, including the cloned avirulence genes, other putative secreted proteins, as well as some other predicted Pathogen-Host Interaction (PHI) genes. Genomic sequence comparison also identified many genomic rearrangements. Conclusion: Taken together, our results suggested that the genomic sequence of the P. penniseti P1609 could be a useful resource for the genetic study of the Pennisetum-infecting Pyricularia species.