Significance The N -glycan composition of the constant (Fc) domain of IgG can modulate antibody effector functions by affecting the ability of the Fc to bind various Fc receptors (FcγRs). Most therapeutic IgG antibodies carry heterogeneous N -glycans, which might not be optimal for their therapeutic purpose. To understand the contribution of each N -glycan component on antibody effector function, we generated homogeneous IgG1 glycoforms using a chemoenzymatic approach and performed side-by-side in vitro binding, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), and in vivo IgG-mediated cell depletion assays. Our results confirm the dominant positive effect of removing the core fucose on FcγRIIIA binding and ADCC. Our study further reveals that sialylation adversely impacts ADCC in the context of core fucosylation but not in its absence.

The fine structures of Fc N-glycans can modulate the effector functions of IgG antibodies. It has been demonstrated that lack of the core fucose on the Fc N-glycans leads to drastic enhancement of antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), while terminal α2,6-sialylation of Fc glycan plays a critical role for the anti-inflammatory activity of human intravenous immunoglobulin (IVIG). We describe in this paper a highly efficient chemoenzymatic method for site-selective Fc glycoengineering of intact monoclonal antibody and IVIG. Two new glycosynthase mutants (EndoS-D233A and D233Q) were generated by site-directed mutagenesis of EndoS (an endoglycosidase from Streptococcus pyogenes) and were found to be capable of efficiently transferring predefined N-glycans from corresponding glycan oxazolines to the Fc-deglycosylated intact IgGs without product hydrolysis. As a model study, rituximab (a therapeutic monoclonal antibody) was successfully transformed from mixtures of G0F, G1F, and G2F glycoforms to well-defined homogeneous glycoforms, including a fully sialylated (S2G2F) glycoform that may gain anti-inflammatory activity, a nonfucosylated G2 glycoform that showed significantly enhanced FcγIIIa receptor-binding activity, and an azido-tagged glycoform that can be further transformed into other glycoforms. We also found that EndoS could selectively remove the Fc N-glycans in the presence of FAB glycosylation. This finding, coupled with the remarkable transglycosylation activity of the EndoS glycosynthase mutants, permitted a highly selective glycoengineering of the IVIG's Fc glycans into a fully sialylated Fc glycoform, which may possess significantly enhanced anti-inflammatory activity. The glycoengineering approach described here provides a general platform to modulate the effector functions of IgG antibodies, enabling the optimization of therapeutic efficacy and gain of new functions of monoclonal antibodies and IVIG.

IgG molecules exert both pro- and antiinflammatory effector functions based on the composition of the fragment crystallizable (Fc) domain glycan. Sialylated IgG Fc domains have antiinflammatory properties that are attributed to their ability to increase the activation threshold of innate effector cells to immune complexes by stimulating the upregulation of the inhibitory Fcγ receptor IIB (FcγRIIB). Here, we report that IgG Fc sialylation of human monoclonal IgG1 molecules impairs their efficacy to induce complement-mediated cytotoxicity (CDC). Fc sialylation of a CD20-targeting antibody had no impact on antibody-dependent cellular cytotoxicity and did not change the affinity of the antibody for activating Fcγ receptors. In contrast, the presence of sialic acid abrogated the increased binding of C1q to Fc-galactosylated IgG1 and resulted in decreased levels of C3b deposition on the cell surface. Similar to monoclonal antibodies, sialic acid inhibited the increased C1q binding to galactosylated Fc fragments in human polyclonal IgG. In sera derived from patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, an autoimmune disease of the peripheral nervous system in which humoral immune responses mediate tissue damage, induction of IgG Fc sialylation was associated with clinical disease remission. Thus, impairment of CDC represents an FcγR-independent mechanism by which Fc-sialylated glycovariants might limit proinflammatory IgG effector functions.

Targeted quantification of proteins is a standard methodology with broad utility, but targeted quantification of glycoproteins has not reached its full potential. The lack of optimized workflows and isotopically labeled standards limits the acceptance of glycoproteomics quantification. In this paper, we introduce an efficient and streamlined chemoenzymatic synthesis of a library of isotopically labeled glycopeptides of IgG1 which we use for quantification in an energy optimized LC-MS/MS-PRM workflow. Incorporation of the stable isotope labeled N-acetylglucosamine enables an efficient monitoring of all major fragment ions of the glycopeptides generated under the soft collision induced dissociation (CID) conditions which reduces the CVs of the quantification to 0.7-2.8%. Our results document, for the first time, that the workflow using a combination of stable isotope labeled standards with intra-scan normalization enables quantification of the glycopeptides by an electron transfer dissociation (ETD) workflow as well as the CID workflow with the highest sensitivity compared to traditional workflows., This was exemplified by a rapid quantification (13-minute) of IgG1 Fc glycoforms from COVID-19 patients.

ABSTRACT Emerging of SARS-CoV-2 variants and waning of vaccine/infection-induced immunity poses threats to curbing the COVID-19 pandemic. An effective, safe, and convenient booster vaccine will be needed. We hypothesized that a variant-modified mucosal booster vaccine might induce local immunity to prevent SARS-CoV-2 infection at the port of entry. The beta-variant is hardest to cross-neutralize. Herein we assessed the protective efficacy of an intranasal booster composed of beta variant-spike protein S1 with IL-15 and TLR agonists in previously immunized macaques. The macaques were first vaccinated with Wuhan strain S1 with the same adjuvant. One year later, negligibly detectable SARS-CoV-2-specific antibody remained. Nevertheless, the booster induced vigorous humoral immunity including serum- and bronchoalveolar lavage (BAL)-IgG, secretory nasal- and BAL-IgA, and neutralizing antibody against the original strain and/or beta variant. Beta-variant S1-specifc CD4 + and CD8 + T cell responses were also elicited in PBMC and BAL. Following SARS-CoV-2 beta variant challenge, the vaccinated group demonstrated significant protection against viral replication in the upper and lower respiratory tracts, with almost full protection in the nasal cavity. The fact that one intranasal beta-variant booster administrated one year after the first vaccination provoked protective immunity against beta variant infections may inform future SARS-CoV-2 booster design and administration timing.

Abstract Human immunoglobulin G (IgG) antibodies are one of the most important classes of biotherapeutic agents and undergo glycosylation at the conserved N297 site in the C H 2 domain, which is critical for IgG Fc effector functions and anti-inflammatory activity. Hence, technologies for producing authentically glycosylated IgGs are in high demand. While attempts to engineer Escherichia coli for this purpose have been described, they have met limited success due in part to the lack of available oligosaccharyltransferase (OST) enzymes that can install N- linked glycans within the QYNST sequon of the IgG C H 2 domain. Here, we identified a previously uncharacterized single-subunit OST (ssOST) from the bacterium Desulfovibrio marinus that exhibited greatly relaxed substrate specificity and, as a result, was able to catalyze glycosylation of native C H 2 domains in the context of both a hinge-Fc fragment and a full-length IgG. Although the attached glycans were bacterial in origin, conversion to a homogeneous, asialo complex-type G2 N -glycan at the QYNST sequon of the E. coli -derived hinge-Fc was achieved via chemoenzymatic glycan remodeling. Importantly, the resulting G2-hinge-Fc exhibited strong binding to human FcγRIIIa (CD16a), one of the most potent receptors for eliciting antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). Taken together, the discovery of Dm PglB provides previously unavailable biocatalytic capabilities to the bacterial glycoprotein engineering toolbox and opens the door to using E. coli for the production and glycoengineering of human IgGs and fragments derived thereof.

Galectins are β-galactosyl-binding lectins with key roles in early development, immune regulation, and infectious disease. Influenza A virus (IAV) infects the airway epithelia, and in severe cases may lead to bacterial superinfections and hypercytokinemia, and eventually, to acute respiratory distress syndrome (ARDS) through the breakdown of airway barriers. The detailed mechanisms involved, however, remain poorly understood. Our prior in vivo studies in a murine model system revealed that upon experimental IAV and pneumococcal primary and secondary challenges, respectively, galectin-1 and galectin-3 (Gal-3) are released into the airway and bind to the epithelium that has been desialylated by the viral neuraminidase, contributing to secondary bacterial infection and hypercytokinemia leading to the clinical decline and death of the animals. Here we report the results of in vitro studies that reveal the role of the extracellular Gal-3 in additional detrimental effects on the host by disrupting the integrity of the airway epithelial barrier. IAV infection of the human airway epithelia cell line A549 increased release of Gal-3 and its binding to the A549 desialylated cell surface, notably to the transmembrane signaling receptors CD147 and integrin-β1. Addition of recombinant Gal-3 to A549 monolayers resulted in enhanced expression and release of matrix metalloproteinases, leading to disruption of cell-cell tight junctions, and a significant increase in paracellular permeability. This study reveals a critical mechanism involving Gal-3 that may significantly contribute to the severity of IAV infections by promoting disruption of tight junctions and enhanced permeability of the airway epithelia, potentially leading to lung edema and ARDS.

ABSTRACT Mass spectrometry (MS) can unlock crucial insights into the intricate world of glycosylation analysis. Despite its immense potential, the qualitative and quantitative analysis of isobaric glycopeptide structures remains one of the most daunting hurdles in the field of glycoproteomics. The ability to distinguish between these complex glycan structures poses a significant challenge, hindering our ability to accurately measure and understand the role of glycoproteins in biological systems. A few recent publications described the use of collision energy (CE) modulation to improve structural elucidation, especially for qualitative purposes. Different linkages of glycan units usually demonstrate different stabilities under CID/HCD fragmentation conditions. Fragmentation of the glycan moiety produces low molecular weight ions (oxonium ions) that can serve as a structure-specific signature for specific glycan moieties, however, specificity of these fragments has never been examined closely. Here, we investigated fragmentation specificity using synthetic stable isotope-labelled glycopeptide standards. These standards were isotopically labelled at the reducing terminal GlcNAc, which allowed us to resolve fragments produced by oligomannose core moiety and fragments generated from outer antennary structures. Our research identified the potential for false positive structure assignments due to the occurrence of “Ghost” fragments resulting from single glyco unit rearrangement or mannose core fragmentation within the collision cell. To mitigate this issue, we have established a minimal intensity threshold for these fragments to prevent the misidentification of structure-specific fragments in glycoproteomics analysis. Our findings provide a crucial step forward in the quest for more accurate and reliable glycoproteomics measurements. Graphical abstract