e15085 Background: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a challenging cancer with a 5-year survival rate of under 12%. More than 90% of PDAC cases involve KRAS mutations. KRAS G12C inhibitors recently developed have limited use because only 3% of PDAC express this mutation, highlighting the urgent need for pan-RAS inhibitors to address the complex mutation landscape in PDAC while avoiding resistance mechanisms. We synthesized and evaluated a novel pan-RAS inhibitor, ADT-1004, in mouse tumor models transplanted with mouse PDAC cell lines or patient-derived xenografts. ADT-1004 is an orally bioavailable prodrug of ADT-007, a highly potent and selective pan-RAS inhibitor (doi.org/10.1101/2023.05.17.541233). Methods: Human and mouse PDAC cell lines were utilized to evaluate in vitro growth inhibitory potency and selectivity of ADT-007. For in vivo experiments, KPC-Luc (1 × 10 5 ) and 2838C3-Luc (1.5 × 10 5 ) PDAC cells harboring the KRAS G12D mutation were injected into the pancreas of C57BL/6J mice. After one week, the mice were randomly divided into treatment groups (n = 7 per group) and received oral ADT-1004 at a dose of 40mg/kg body weight five times a week for 4 weeks. Tumor burden was assessed weekly by monitoring bioluminescence signals using the IVIS Xenogen imaging system. Four patient-derived xenografts from PDAC patients with KRAS G12C , KRAS G12D , KRAS G12V , KRAS G13Q mutations were subcutaneously implanted in NSG mice by a small incision in the right flank. A week later, when the tumors reached a size of 100mm 3 mice were randomized (n = 7 per group) and treated orally with 40mg/kg of ADT-1004 five times a week for 6 weeks. Body weight and tumor size were measured twice weekly. Results: ADT-007 potently and selectively inhibited the growth of human and mouse PDAC cell lines. For example, the IC 50 value of ADT-007 for KRAS G12C MIA PaCA-2 PDAC cells was as low as 2 nM compared to 2500 nM for RAS WT BxPC3 PDAC cells. Growth inhibition was dependent on activated RAS and associated with reduced GTP-RAS levels and MAPK/AKT signaling. ADT-1004 was well tolerated in mice at a dose up to 175 mg/kg bid orally with sustained plasma levels of ADT-007 far exceeding growth IC 50 values. When administered orally at 40 mg/kg body weight, ADT-1004 displayed robust antitumor activity in mouse tumor models using patient or mouse derived PDAC cell lines with G12D, G12V, G12C, or G13Q KRAS mutations, causing significant inhibitory effects on ERK phosphorylation. Conclusions: ADT-1004 inhibited tumor growth of KRAS mutant PDA tumors by targeting activated RAS to disrupt downstream MAPK/AKT signaling. The results highlight the promise of ADT-1004 as a novel pan-RAS inhibitor and open new strategies for addressing the complex genetic landscape of PDAC and other RAS driven cancers.

RAS is a common driver of cancer that was considered undruggable for decades. Recent advances have enabled the development of RAS inhibitors, but the efficacy of these inhibitors remains limited by resistance. Here, we developed a pan-RAS inhibitor, ADT-007, that binds nucleotide-free RAS to block GTP activation of effector interactions and MAPK/AKT signaling, resulting in mitotic arrest and apoptosis. ADT-007 potently inhibited the growth of RAS mutant cancer cells irrespective of the RAS mutation or isozyme, and RASWT cancer cells with GTP-activated RAS from upstream mutations were equally sensitive. Conversely, RASWT cancer cells harboring downstream BRAF mutations and normal cells were essentially insensitive to ADT-007. Sensitivity of cancer cells to ADT-007 required activated RAS and dependence on RAS for proliferation, while insensitivity was attributed to metabolic deactivation by UDP-glucuronosyltransferases that were expressed in RASWT and normal cells but repressed in RAS mutant cancer cells. ADT-007 displayed unique advantages over KRAS mutant-specific, pan-KRAS, and pan-RAS inhibitors that could impact in vivo antitumor efficacy by escaping compensatory mechanisms that lead to resistance. Local administration of ADT-007 showed robust antitumor activity in syngeneic immune-competent and xenogeneic immune-deficient mouse models of colorectal and pancreatic cancer. The antitumor activity of ADT-007 was associated with the suppression of MAPK signaling and activation of innate and adaptive immunity in the tumor immune microenvironment. Oral administration of ADT-007 prodrug also inhibited tumor growth. Thus, ADT-007 has the potential to address the complex RAS mutational landscape of many human cancers and to improve treatment of RAS-driven tumors.

ABSTRACT Here we describe a novel class of pan-RAS inhibitor with highly potent and selective anticancer activity by killing cancer cells harboring mutations in RAS or with constitutively activated RAS resulting from mutations in upstream signaling components. A lead compound from this chemical family, ADT-007, binds RAS when in a nucleotide free transitional state to block loading of GTP, thereby interfering with RAS activation and disruption of binding to effectors such as RAF and PI3K to suppress MAPK and AKT signaling. ADT-007 potently inhibits the growth of cultured human and murine cancer cell lines with single-digit nM IC50 values irrespective of specific RAS isozyme or mutational codon. ADT-007 also inhibits tumor growth in vivo through inhibition of RAS-MAPK signaling in syngeneic, immune competent and xenogeneic, immune deficient mouse models of colon and pancreatic cancer. In RAG 1 -/- mice the activity of ADT-007 is partially inhibited indicating a role for the adaptive immune system in ADT-007-mediated tumor growth inhibition. Ex vivo analyses of tumor infiltrating leukocytes, reveals that ADT-007 enhances T cell functions in the pancreatic and colorectal tumor immune microenvironment. SIGNIFICANCE ADT-007 represents a 1st-in-class pan-RAS inhibitor with broad anticancer activity across all RAS driven cancers and unique chemical selectivity to allow normal cells to be spared from pan-RAS inhibition. ADT-007 also has the potential to modulate the adaptive immune response in colorectal cancer (CRC) and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA). These data support future clinical trials of an orally bioavailable prodrug of ADT-007 as a monotherapy for the treatment of patients with CRC or PDAC regardless of the underlying mutation or in combination with immunotherapy.

e15084 Background: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains a formidable challenge due to its late diagnosis and limited treatment options. KRAS mutations and activation of Wnt/β-catenin pathway components that drive aberrant signaling cascades resulting in uncontrolled cellular proliferation and metastasis occur in a majority of PDAC patients. The development of mutant specific KRAS inhibitors has emerged as a promising approach to counter the oncogenic impact of KRAS mutations, although have limited use for PDAC given the complex mutational landscape, while inhibitors of Wnt/β-catenin signaling remain elusive. Novel target-directed drugs that effectively tackle the complex mutational status in KRAS mutant PDAC are urgently needed. A novel pan-RAS/β-catenin inhibitor, ADT-030, was evaluated in mouse tumor models of PDAC harboring KRAS G12C or KRAS G12D mutations. Methods: PDAC cell lines 2838c3 (KRAS G12D ), MIA PaCa-2 (KRAS G12C ), and BxPC-3 (RAS WT ) were utilized to evaluate in vitro growth inhibitory potency and selectivity of ADT-030. Assays for colony formation, apoptosis, and cell cycle, along with western blotting for RAS signaling were also conducted. A murine model involving 2838c3-Luc KRAS G12D PDAC cells injected into the pancreas of C57BL/6J mice was used to evaluate in vivo antitumor activity of ADT-030. ADT-030 was administered orally once daily at dosages of 50, 100, and 150mg/kg body weight, 5x/week for 4 weeks. Tumor growth was monitored by bioluminescence imaging using an IVIS Xenogen system. Body weights were measured twice weekly. Pancreatic tumors were collected and weighed at the end of treatment. Results: ADT-030 produced potent inhibition of proliferation of human and murine PDAC cells harboring KRAS G12D and KRAS G12C mutations. Annexin V assay revealed the capacity of ADT-030 to trigger apoptosis, specifically in KRAS mutant cells with minimal impact on BxPC3 RAS WT cells. Cell cycle analysis using Propidium Iodide staining revealed the ability of ADT-030 to arrest cells in the G2/M phase of the cell cycle. Western blot for detecting the key RAS signaling molecule P-ERK1/2 showed decreased levels following ADT-030 treatment. Other experiments revealed that ADT-030 and related analogs simultaneously suppress both MAPK/AKT signaling and β-catenin transcriptional activity (doi: 10.1186/s13048-022-01050-9). In an orthotopic xenograft model in which 2838c3-Luc cells were implanted in the pancreas, oral administration of 50, 100, and 150mg/kg of ADT-030 was well tolerated and inhibited tumor growth by 64.2%, 72.8%, and 80%, respectively, after 4 weeks of treatment. Conclusions: These compelling results position ADT-030 as a novel dual pan-RAS/β-catenin inhibitor for combating the challenges posed by complex mutations in PDAC and other RAS driven cancers and support its clinical evaluation as a valuable therapeutic alternative to mutant-specific KRAS inhibitors.