Abstract Histone H2AX plays a key role in DNA damage signalling in the surrounding regions of DNA double-strand breaks (DSBs). In response to DNA damage, H2AX becomes phosphorylated on serine residue 139 (known as γH2AX), resulting in the recruitment of the DNA repair effectors 53BP1 and BRCA1. Here, by studying resistance to poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors in BRCA1/2-deficient mammary tumours, we identify a function for γH2AX in orchestrating drug-induced replication fork degradation. Mechanistically, γH2AX-driven replication fork degradation is elicited by suppressing CtIP-mediated fork protection. As a result, H2AX loss restores replication fork stability and increases chemoresistance in BRCA1/2-deficient tumour cells without restoring homology-directed DNA repair, as highlighted by the lack of DNA damage-induced RAD51 foci. Furthermore, in the attempt to discover acquired genetic vulnerabilities, we find that ATM but not ATR inhibition overcomes PARP inhibitor (PARPi) resistance in H2AX-deficient tumours by interfering with CtIP-mediated fork protection. In summary, our results demonstrate a role for H2AX in replication fork biology in BRCA-deficient tumours and establish a function of H2AX separable from its classical role in DNA damage signalling and DSB repair.

Histone H2AX plays a key role in DNA damage signalling in the surrounding regions of DNA double-strand breaks (DSBs) 1,2 . In response to DNA damage, H2AX becomes phosphorylated on serine residue 139 (known as γH2AX), resulting in the recruitment of the DNA repair effectors 53BP1 and BRCA1 3–6 . Here, by studying resistance to poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors in BRCA1/2-deficient mammary tumours 7,8 , we identify a novel function for γH2AX in orchestrating drug-induced replication fork degradation. Mechanistically, γH2AX-dependent replication fork degradation is elicited by the inhibition of CtIP-mediated fork protection. As a result, H2AX loss restores replication fork stability and increases chemoresistance in BRCA1/2-deficient tumour cells without restoring homology-directed DNA repair, as highlighted by the lack of DNA damage-induced RAD51 foci. Furthermore, in the attempt to discover acquired genetic vulnerabilities, we find that ATM inhibition overcomes PARP inhibitor (PARPi) resistance in H2AX-deficient tumours by interfering with CtIP-mediated fork protection of stalled forks. In summary, our results demonstrate a novel role for H2AX in replication fork biology in BRCA-deficient tumours and establish a function of H2AX separable from its classical role in DNA damage signalling and DSB repair.

Human CtIP plays a critical role in homologous recombination (HR) by promoting the resection of DNA double-strand breaks. Moreover, CtIP maintains genome stability through protecting stalled replication forks from nucleolytic degradation. However, the upstream signaling mechanisms governing the molecular switch between these two CtIP-dependent processes remain largely elusive. Here, we show that phosphorylation of CtIP by the p38a stress kinase and subsequent PIN1-mediated CtIP cis-to-trans isomerization is required for fork stabilization but dispensable for HR. We found that stalled forks are degraded in cells expressing non-phosphorylatable CtIP or lacking PIN1-p38a activity, while expression of a CtIP trans-locked mutant overcomes the requirement for PIN1-p38a in fork protection. We further reveal that Brca1-deficient mammary tumor cells that have acquired PARPi resistance regain chemosensitivity after PIN1 or p38a inhibition. Collectively, our findings identify the PIN1-p38-CtIP signaling pathway as a critical regulator of replication fork integrity.