Healthy Research Rewards
ResearchHub is incentivizing healthy research behavior. At this time, first authors of open access papers are eligible for rewards. Visit the publications tab to view your eligible publications.
Got it
NS
Naoaki Sakamoto
Author with expertise in Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated proteins
Achievements
Open Access Advocate
Cited Author
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
8
(75% Open Access)
Cited by:
661
h-index:
23
/
i10-index:
35
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9

Shota Nakade et al.Nov 20, 2014
Genome engineering using programmable nucleases enables homologous recombination (HR)-mediated gene knock-in. However, the labour used to construct targeting vectors containing homology arms and difficulties in inducing HR in some cell type and organisms represent technical hurdles for the application of HR-mediated knock-in technology. Here, we introduce an alternative strategy for gene knock-in using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) mediated by microhomology-mediated end-joining, termed the PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) system. TALEN-mediated PITCh, termed TAL-PITCh, enables efficient integration of exogenous donor DNA in human cells and animals, including silkworms and frogs. We further demonstrate that CRISPR/Cas9-mediated PITCh, termed CRIS-PITCh, can be applied in human cells without carrying the plasmid backbone sequence. Thus, our PITCh-ing strategies will be useful for a variety of applications, not only in cultured cells, but also in various organisms, including invertebrates and vertebrates.
0
Citation449
0
Save
13

Detailed profiling with MaChIAto reveals various genomic and epigenomic features affecting the efficacy of knock-out, short homology-based knock-in and Prime Editing

Kazuki Nakamae et al.Jun 30, 2022
Abstract Highly efficient gene knock-out and knock-in have been achieved by harnessing CRISPR-Cas9 and its advanced technologies such as Prime Editor. In addition, various bioinformatics resources have become available to quantify and qualify the efficiency and accuracy of CRISPR edits, which significantly increased the user-friendliness of the general next-generation sequencing (NGS) analysis in the context of genome editing. However, there is no specialized and integrated software for investigating the preference in the genomic context involved in the efficiency and accuracy of genome editing using CRISPR-Cas9 and beyond. Here, we address this issue by establishing a novel analysis platform of NGS data for profiling the outcome of template-free knock- out and short homology-based editing, named MaChIAto ( M icrohomology- a ssociated Ch romosomal I ntegration/editing A nalysis to ols) ( https://github.com/KazukiNakamae/MaChIAto ). MaChIAto accommodates the classification and profiling of the NGS reads to uncover the tendency of the corresponding method of genome editing. In the profiling function, MaChIAto can summarize the mutation patterns along with the editing efficiency, and > 70 kinds of feature analysis, e.g., correlation analysis with thermodynamics and secondary structure parameters, are available. Additionally, the classifying function of MaChIAto is based on, but much stricter than, that of the existing tool, which is achieved by implementing a novel method of parameter adaptation utilizing Bayesian optimization. To demonstrate the functionality of MaChIAto, we analyzed the NGS data of knock- out, short homology-based knock-in, and Prime Editing. We confirmed that some features of (epi-)genomic context affected the efficiency and accuracy. These results show that MaChIAto is a helpful tool for understanding the best design for CRISPR edits. More importantly, it is the first tool for discovering features in the short homology-based knock-in outcomes. MaChIAto would help researchers profile editing data and generate prediction models for CRISPR edits, further contributing to revealing a “black box” process to produce a variety of CRISPR and Prime Editing outcomes.
13
Citation1
0
Save
1

The Crucial Role of CTCF in Mitotic Progression during Early Development of Sea Urchin

Kaichi Watanabe et al.May 26, 2023
Abstract CCCTC-binding factor (CTCF), an insulator protein with 11 zinc fingers, is enriched at the boundaries of topologically associated domains (TADs) in eukaryotic genomes. In this study, we isolated and analyzed the cDNAs encoding HpCTCF, the CTCF homolog in the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus , to investigate its expression patterns and functions during early development of sea urchin. HpCTCF contains nine zinc fingers corresponding to fingers 2–10 of the vertebrate CTCF. The expression pattern analysis revealed that HpCTCF mRNA was detected at all developmental stages and in the entire embryo. Upon expressing the HpCTCF-GFP fusion protein in early embryos, we observed its uniform distribution within interphase nuclei. However, during mitosis, it disappeared from the chromosomes and subsequently reassembled on the chromosome during telophase. Moreover, the morpholino-mediated knockdown of HpCTCF resulted in mitotic arrest during the morula-to-blastula stage. Most of the arrested chromosomes were not phospholylated at serine 10 of histone H3, indicating that mitosis was arrested at the telophase by HpCTCF depletion. Furthermore, impaired sister chromatid segregation was observed using time-lapse imaging of HpCTCF-knockdown embryos. Thus, HpCTCF is essential for mitotic progression during the early development of sea urchins, especially during the telophase-to-interphase transition. However, the normal development of pluteus larvae in CRISPR-mediated HpCTCF knockout embryos suggests that disruption of zygotic HpCTCF expression has little effect on embryonic and larval development.
2

Partial exogastrulation due to apical-basal polarity of F-actin distribution disruption in sea urchin embryo by omeprazole

Kaichi Watanabe et al.Sep 1, 2021
Abstract Gastrulation is a universal process in the morphogenesis of many animal embryos. Although morphological and molecular events in gastrulation have been well studied, the mechanical driving forces and underlying regulatory mechanisms are not fully understood. Here, we investigated the gastrulation of embryos of a sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus , which involves the invagination of a single-layered vegetal plate into the blastocoel. We observed that omeprazole, a proton pump inhibitor capable of perturbing the left-right asymmetry of sea urchin embryo, induced “partial exogastrulation” where the secondary invagination proceeds outward. During early gastrulation, intracellular apical-basal polarity of F-actin distribution in vegetal half were higher than those in animal half, while omeprazole treatment disturbed the apical-basal polarity of F-actin distribution in vegetal half. Furthermore, gastrulation stopped and even partial exogastrulation did not occur when F-actin polymerization or degradation in whole embryo was partially inhibited via RhoA or YAP1 knockout. A mathematical model of the early gastrulation reproduced the shapes of both normal and exogastrulating embryos using cell-dependent cytoskeletal features based on F-actin. Additionally, such cell position-dependent intracellular F-actin distributions might be regulated by intracellular pH distributions. Therefore, apical-basal polarity of F-actin distribution disrupted by omeprazole may induce the partial exogastrulation via anomalous secondary invagination.
0

Insulator Activities of Nucleosome-Excluding DNA Sequences Without Bound Chromatin Looping Proteins

Yuki Matsushima et al.Jan 4, 2019
Chromosomes consist of various domains with different transcriptional activities separated by chromatin boundary sequences such as insulator sequences. Recent studies suggested that CTCF or other chromatin loop-forming protein binding sequences represented typical insulators. Alternatively, some long nucleosome-excluding DNA sequences were also reported to exhibit insulator activities in yeast and sea urchin chromosomes although specific binding of loop-forming proteins were not expected for them. However, the mechanism of the insulator activities of these sequences and the possibilities of similar insulators existing in other organisms remained unclear. In this study, we first constructed and performed simulations of a coarse-grained chromatin model containing nucleosome-rich and nucleosome-excluding DNA regions. We found that a long nucleosome-excluding region between two nucleosome-rich regions could markedly hinder the associations of two neighboring chromatin regions owing to the stronger long-term-averaged rigidity of the nucleosome-excluding region compared to that of nucleosome-rich regions. Subsequent analysis of the genome wide nucleosome positioning, protein binding, and DNA rigidity in human cells revealed that some nucleosome-excluding rigid DNA sequences without bound chromatin looping proteins could exhibit insulator activities, functioning as chromatin boundaries in various regions of human chromosomes.
0

Assembly of continuous high-resolution draft genome sequence of Hemicentrotus pulcherrimus using long-read sequencing

Tetsushi Komoto et al.Jan 1, 2023
The update of the draft genome assembly of sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus, which is widely studied in East Asia as a model organism of early development, was performed using Oxford nanopore long-read sequencing. The updated assembly provided ~600 Mb genome sequences divided into 2,163 contigs with N50 = 516 kb. BUSCO completeness score and transcriptome model mapping ratio (TMMR) of the present assembly were obtained as 96.5 % and 77.8 % respectively. These results were more continuous with higher resolution than those by the previous version of H. pulcerrimus draft genome, HpulGenome_v1, where the number of scaffolds = 16,251 with a total of ~100 Mb gaps, N50 = 143 kb, BUSCO completeness score = 86.1 %, and TMMR = 40.61. The obtained genome contained 36,055 gene models that were consistent with those in other echinoderms. Additionally, two tandem repeat sequences of early histone gene locus containing 47 copies and 34 copies of all histone genes, and 185 of the homologous sequences of the interspecifically conserved region of the Ars insulator, ArsInsC, were obtained. These results provide further advance for genome-wide research of development, gene regulation, and intranuclear structural dynamics of multicellular organisms using Hemicentrotus pulcherrimus.
0

Possibilities of skin coat color-dependent risks and risk factors of squamous cell carcinoma and deafness of domestic cats inferred via RNA-seq data

Akinori Awazu et al.Jul 19, 2023
Abstract The transcriptome data of skin cells from domestic cats with brown, orange, and white coats were analyzed using a public database to investigate the possible relationship between coat color-related gene expression and squamous cell carcinoma risk, as well as the mechanism of deafness in white cats. We found that the ratio of the expression level of genes suppressing squamous cell carcinoma to that of genes promoting squamous cell carcinoma might be considerably lower than the theoretical estimation in skin cells with orange and white coats in white-spotted cat. We also found the possibility of the frequent production of KIT lacking the first exon (d1KIT) in skin cells with white coats, and d1KIT production exhibited a substantial negative correlation with the expression of SOX10, which is essential for melanocyte formation and adjustment of hearing function. Additionally, the production of d1KIT was expected to be due to the insulating activity of the feline endogenous retrovirus 1 (FERV1) LTR in the 1st intron of KIT and its CTCF binding sequence repeat. These results contribute to basic veterinary research to understand the relationship between cat skin coat and disease risk, as well as the underlying mechanism.