ABSTRACT Bacterial membranes are complex mixtures with dispersity that is dynamic over scales of both space and time. In order to capture adsorption onto and transport within these mixtures, we conduct simultaneous second harmonic generation (SHG) and two photon fluorescence measurements on two different gram-positive bacterial species as the cells uptake membrane-specific probe molecules. Our results show that SHG can not only monitor the movement of small molecules across membrane leaflets, but is also sensitive to higher-level ordering of the molecules within the membrane. Further, we show that the membranes of Staphylococcus aureus remain more dynamic after longer times at room temperature in comparison to Enterococcus faecalis . Our findings provide insight into the variability of activities seen between structurally similar molecules in gram-positive bacteria while also demonstrating the power of SHG to examine these dynamics. STATEMENT OF SIGNIFICANCE Bacterial membranes are highly adept at discerning and modifying their interactions with different small molecules in their environment. Here we show how second harmonic generation (SHG) spectroscopy can track the dynamics of structurally similar membrane probes in two gram-positive bacterial species. Our results reveal behavior that is dependent on both the probe molecule and the membrane composition. Specifically, we observe flip-flop between leaflets for one molecule, while the other molecule produces a signal indicative of larger scale ordering in the membrane. These phenomena can all be explained by considering potential differences in the membrane fluidity and surface charge between the two bacterial species. Overall, our work highlights the dynamic differences between bacterial membranes and SHG’s sensitivity to probing these systems.

A bstract Bacteria shape interactions between hosts and fungal pathogens. In some cases, bacteria associated with fungi are essential for pathogen virulence. In other systems, host associated microbiomes confer resistance against fungal pathogens. We studied an aphid-specific entomopathogenic fungus called Pandora neoaphidis in the context of both host and pathogen microbiomes. Aphids host several species of heritable bacteria, some of which confer resistance against Pandora . We first found that spores that emerged from aphids that harbored protective bacteria were less virulent against subsequent hosts and did not grow on plate media. We then used 16S amplicon sequencing to study the bacterial microbiome of fungal mycelia and spores during plate culturing and host infection. We found that the bacterial community is remarkably stable in culture despite dramatic changes in pathogen virulence. Last, we used an experimentally transformed symbiont of aphids to show that Pandora can acquire hostassociated bacteria during infection. Our results uncover new roles for bacteria in the dynamics of aphidpathogen interactions and illustrate the importance of the broader microbiological context in studies of fungal pathogenesis.

A bstract Insects are an important reservoir of viral biodiversity, but the vast majority of viruses associated with insects have not been discovered. Recent studies have therefore employed high-throughput sequencing of RNA, which has led to rapid advances in our understanding of insect viral diversity. However, insect genomes frequently contain transcribed endogenous viral elements with significant homology to exogenous viruses, complicating the use of RNAseq for viral discovery. In this study, we use a multi-pronged sequencing approach to study the virome of an important agricultural pest and prolific vector of plant pathogens, the potato aphid Macrosiphum euphorbiae . We first used rRNA-reduced RNAseq to characterize the bacteria and viruses found in individual insects. We then characterized the frequency of a heritable Flavivirus and an Ambidensovirus in our population. We next generated a quality draft genome assembly for M. euphorbiae using Illumina-corrected Nanopore sequencing. This analysis showed that the Ambidensovirus, previously described from an RNAseq viral screen, is not a exogenous virus and instead is a transcribed endogenous viral element in the M. euphorbiae genome. Our study generates key insight into an important agricultural pest and highlights a widespread challenge for the study of viral diversity using RNAseq.

ABSTRACT Bacteria shape interactions between hosts and fungal pathogens. In some cases, bacteria associated with fungi are essential for pathogen virulence. In other systems, host-associated microbiomes confer resistance against fungal pathogens. We studied an aphid-specific entomopathogenic fungus called Pandora neoaphidis in the context of both host and pathogen microbiomes. Aphids host several species of heritable bacteria, some of which confer resistance against Pandora . We first found that spores that emerged from aphids that harbored protective bacteria were less virulent against subsequent hosts and did not grow on plate media. We then used 16S amplicon sequencing to study the bacterial microbiome of fungal mycelia and spores during plate culturing and host infection. We found that the bacterial community is remarkably stable in culture despite dramatic changes in pathogen virulence. Last, we used an experimentally transformed symbiont of aphids to show that Pandora can acquire host-associated bacteria during infection. Our results uncover new roles for bacteria in the dynamics of aphid-pathogen interactions and illustrate the importance of the broader microbiological context in studies of fungal pathogenesis. IMPORTANCE Entomopathogenic fungi play important roles in the population dynamics of many insect species. Understanding the factors shaping entomopathogen virulence is critical for agricultural management and for the use of fungi in pest biocontrol. We show that heritable bacteria in aphids, which confer protection to their hosts against fungal entomopathogens, influence virulence against subsequent hosts. Aphids reproduce asexually and are typically surrounded by genetically identical offspring, and thus these effects likely shape the dynamics of fungal disease in aphid populations. Furthermore, fungal entomopathogens are known to rapidly lose virulence in lab culture, complicating their laboratory use. We show that this phenomenon is not driven by changes in the associated bacterial microbiome. These results contribute to our broader understanding of the aphid model system and shed light on the biology of the Entomophthorales—an important but understudied group of fungi.