We demonstrate stable three-dimensional (3D) single-beam optical trapping of gold nanoparticles with diameters between 18 and 254 nm. Three-dimensional power spectral analysis reveals that, for nanoparticles with diameters less than 100 nm, the trap stiffness is proportional to the volume of the particle. For larger particles, the trap stiffness still increases with size, however, less steeply. Finally, we provide numbers for the largest forces exertable on gold nanoparticles.

We describe an active polymer network in which processive molecular motors control network elasticity. This system consists of actin filaments cross-linked by filamin A (FLNa) and contracted by bipolar filaments of muscle myosin II. The myosin motors stiffen the network by more than two orders of magnitude by pulling on actin filaments anchored in the network by FLNa cross-links, thereby generating internal stress. The stiffening response closely mimics the effects of external stress applied by mechanical shear. Both internal and external stresses can drive the network into a highly nonlinear, stiffened regime. The active stress reaches values that are equivalent to an external stress of 14 Pa, consistent with a 1-pN force per myosin head. This active network mimics many mechanical properties of cells and suggests that adherent cells exert mechanical control by operating in a nonlinear regime where cell stiffness is sensitive to changes in motor activity. This design principle may be applicable to engineering novel biologically inspired, active materials that adjust their own stiffness by internal catalytic control.

Abstract Filopodia are actin-rich structures, present on the surface of practically every known eukaryotic cell. These structures play a pivotal role in specific cell-cell and cell-matrix interactions by allowing cells to explore their environment, generate mechanical forces, perform chemical signaling, or convey signals via intercellular tunneling nano-bridges. The dynamics of filopodia appear quite complex as they exhibit a rich behavior of buckling, pulling, length and shape changes. Here, we find that filopodia additionally explore their 3D extracellular space by combining growth and shrinking with axial twisting and buckling of their actin rich core. Importantly, we show the rotational dynamics of the filamentous actin inside filopodia for a range of highly distinct and cognate cell types spanning from earliest development to highly differentiated tissue cells. Non-equilibrium physical modeling of actin and myosin confirm that twist, and hence rotation, is an emergent phenomenon of active filaments confined in a narrow channel which points to a generic mechanism present in all cells. Our measurements confirm that filopodia exert traction forces and form helical buckles in a range of different cell types that can be ascribed to accumulation of sufficient twist. These results lead us to conclude that activity induced twisting of the actin shaft is a general mechanism underlying fundamental functions of filopodia.

Many cellular processes involve the lateral organization of integral and peripheral membrane proteins into nanoscale domains. Despite the biological significance the mechanisms that facilitate membrane protein clustering into nanoscale lipid domains remain enigmatic. In cells the analysis of membrane protein phase affinity is complicated by the size and temporal nature of ordered and disordered lipid domains. To overcome these limitations we developed a method for delivering membrane proteins from transfected cells into phase-separated model membranes that combines optical trapping with thermoplasmonic-mediated membrane fusion and confocal imaging. Using this approach we observed clear phase partitioning following the transfer of GFP-tagged influenza hemagglutinin and neuraminidase from transfected cell membranes to giant unilamellar vesicles. The generic platform presented here allows investigation of the phase affinity of any plasma membrane protein which can be labeled or tagged with a fluorescent marker.

Abstract Annexins (ANXs) are a family of peripheral membrane binding proteins which play a vital role in the maintenance and function of cellular membranes. These proteins are known to be part of the plasma membrane repair machinery where they are known to bind to negatively charged lipids in the cell membrane in a calcium dependent manner. The shape of the plasma membrane is known to be a regulator of protein density and thereby affects several biological functions of the cell such as exo-and endocytosis, cell motility, immune responses and also membrane repair. Membrane deformation and curvature sensing by proteins is a well described phenomenon which can assist in recruitment of specific proteins to certain regions in the cell and facilitate membrane bending. Following ruptures in the plasma membrane, calcium influx assist in the association of ANXs with the membrane around the ruptured area. Due to the expected increase in curvature at the damaged membrane site, it has been suggested that both membrane curvature and Ca 2+ participate in the recruitment of ANXs. We have investigated the curvature sensing of ANXA4 in giant unilamellar vesicles (GUVs) by pulling high curvature membrane tethers from the vesicle surface using optical tweezers showing that ANXA4 recruitment increases with higher membrane curvature. We also describe an assay for determining protein density on the plasma membrane by utilizing ANXA4’s property as a calcium dependent membrane binding protein. This new assay allows us to investigate the effect of protein density on curvature sensing.

Abstract The cellular cytoskeleton provides the cell with mechanical rigidity and mediates mechanical interaction between cells and with the extracellular environment. The actin structure plays a key role in regulating cellular behaviors like motility, cell sorting, or cell polarity. From the earliest stages of development, in naïve stem cells, the critical mechanical role of the actin structure is becoming recognized as a vital cue for correct segregation and lineage control of cells and as a regulatory structure that controls several transcription factors. The ultrastructure of the earliest embryonic stem cells has not been investigated in living cells despite the fact that it is well-known that cells undergo morphological shape changes during the earliest stages of development. Here, we provide 3D investigations of the actin cytoskeleton of naïve mouse embryonic stem cells (ESCs) in clusters of sizes relevant for early stage development using super resolution optical reconstruction microscopy (STORM). We quantitatively describe the morphological, cytoskeletal and mechanical changes appearing between cells in small clusters at the earliest stages of inner cell mass differentiation, as recapitulated by cells cultured under two media conditions, 2i and Serum/LIF, thus promoting the naïve and first primed state, respectively. High resolution images of living stem cells showed that the peripheral actin structure undergoes a dramatic change between the two media conditions. The actin organization changed from being predominantly oriented parallel to the cell surface in 2i medium to a more radial orientation in Serum/LIF. Finally, using an optical trapping based technique, we detected micro-rheological differences in the cell periphery between the cells cultured in these two media, with results correlating well with the observed nano-architecture of the ESCs in the two different differentiation stages. These results pave the way for linking physical properties and cytoskeletal architecture to the development from naïve stem cells to specialized cells. Statement of Significance Cells receive mechanical signals and must provide mechanical feedback, therefore, physical properties are instrumental for cell-cell interactions. Mechanical signals mediated through the cell surface can significantly affect transport of signaling molecules and can influence biological processes like transcriptional regulation. To achieve a deeper insight into how the cytoskeletal structure is responsible for cell shape and material properties at the earliest stages of development, we employ super-resolution microscopy to image actin fibers in clusters of embryonic stem cells mimicking early development. By modification of the culturing conditions, we investigate how the actin cytoskeleton and micro-rheological properties of ESCs change between the naïve ground state and the stage primed towards epiblast, thus revealing a correlation between differentiation stage and cytoskeletal structure.

Filopodia, widely distributed on cell surfaces, are distinguished by their dynamic extensions, playing pivotal roles in a myriad of biological processes. Their functions span from mechanosensing and guidance to cell-cell communication during cellular organization in the early embryo. Filopodia have significant roles in pathogenic processes, such as cancer invasion and viral dissemination. Molecular mapping of the filopodome has revealed generic components essential for filopodia functions. In parallel, recent insights into biophysical mechanisms governing filopodia dynamics have provided the foundation for broader investigations of filopodia's biological functions. We highlight recent discoveries of engagement of filopodia in various stages of development and pathogenesis and present an overview of intricate molecular and physical features of these cellular structures across a spectrum of cellular activities.

The plasma membrane of eukaryotic cells consists of a crowded environment comprised of a high diversity of proteins in a complex lipid matrix. The lateral organization of membrane proteins in the plasma membrane (PM) is closely correlated with biological functions such as endocytosis, membrane budding and other processes which involve protein mediated shaping of the membrane into highly curved structures. Annexin A4 (ANXA4) is a prominent player in a number of biological functions including plasma membrane repair. Its binding to membranes is activated by Ca2+ influx and it is therefore rapidly recruited to the cell surface near rupture sites where Ca2+ influx takes place. However, the free edges near rupture sites can easily bend into complex curvatures and hence may accelerate recruitment of curvature sensing proteins to facilitate rapid membrane repair. To analyze the curvature sensing behavior of curvature inducing proteins in crowded membranes, we quantifify the affinity of ANXA4 monomers and trimers for high membrane curvatures by extracting membrane nanotubes from giant plasma membrane vesicles (GPMVs). ANXA4 is found to be a sensor of negative membrane curvatures. Multiscale simulations furthermore predicted that ANXA4 trimers generate membrane curvature upon binding and have an affinity for highly curved membrane regions only within a well defined membrane curvature window. Our results indicate that curvature sensing and mobility of ANXA4 depend on the trimer structure of ANXA4 which could provide new biophysical insight into the role of ANXA4 in membrane repair and other biological processes.

Abstract Biological systems are regulated by molecular interactions which are tuned by the concentrations of each of the molecules involved. Cells exploit this feature by regulating protein expression, to adapt their responses to overstimulation. Correlating events in single cells to the concentrations of proteins involved can therefore provide important mechanistic insight into cell behavior. Unfortunately, quantification of molecular densities by fluorescence imaging becomes non-trivial due to the diffraction limited resolution of the imaged volume. We show here an alternative approach to overcome this limitation in optical quantification of protein concentrations which is based on calibrating protein volume and surface densities in a model membrane system. We exploit the ability of fluorescently labeled annexin V to bind membranes in presence of calcium. By encapsulating known concentrations of annexin V, we can directly infer the membrane density of annexin V after addition of Ca2+ and correlate the density with the measured fluorescence signal. Our method, named Calmet, enables quantitative determination of the concentration of cytosolic and membrane associated proteins. The applicability of Calmet is demonstrated by quantification of a transmembrane protein receptor (beta 1 adrenergic receptor) labeled by SNAP tagged fluorophores and expressed in HEK293 cells. Calmet is a generic method suitable for the determination of a broad range of concentrations and densities and can be used on regular fluorescence images captured by confocal laser scanning microscopy.