Abstract Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) is a fluorescence imaging technique that allows volumetric imaging at high spatio-temporal resolution to monitor neural activity in live organisms such as larval zebrafish. A major challenge in the construction of a custom SPIM microscope is the control and synchronization of the various hardware components. Here we present a control toolset, μSPIM, built around the open-source MicroManager platform that has already been widely adopted for the control of microscopy hardware. Installation of μSPIM is relatively straightforward, involving a single C++ executable and a Java-based extension to Micro-Manager. Imaging protocols are defined through the μSPIM extension to Micro-Manager. The extension then synchronizes the camera shutter with the galvanometer mirrors to create a light-sheet that is scanned in the z-dimension, in synchrony with the imaging objective, to produce volumetric recordings. A key advantage of μSPIM is that a series of calibration procedures optimizes acquisition for a given set-up making it relatively independent of the optical design of the microscope, or the hardware used to build it. Two laser illumination arms can be used while also allowing for the introduction of illumination masks. μSPIM allows imaging of calcium activity throughout the brain of larval zebrafish at rates of 100 planes per second with single cell resolution as well as slower imaging to reconstruct cell populations, for example, in the cleared brains of mice.

Coral reefs are in alarming decline due to climate emergency, pollution and other man-made disturbances. The numerous ecosystem services derived from coral reefs are underpinned by the growth and physical complexity of reef-forming corals. Our knowledge of their fundamental biology is limited by available technology. We need a better understanding of larval settlement and development, skeletogenesis, interactions with pathogens and symbionts, and how this biology interacts with environmental factors such as light exposure, temperature, and ocean acidification. We here focus on a fast-growing key coloniser, Acropora muricata. To enable dynamic imaging of the photosensitive organism at different scales, we developed light-sheet illumination for fluorescence microscopy of small coral colonies. Our approach reveals live polyps in previously unseen detail. An imaging range for Acropora muricata with no measurable photodamage is defined based upon polyp expansion, coral tissue reaction, and photobleaching. We quantify polyp retraction as a photosensitive behavioural response and show sparse zooxanthellar expulsion and coral tissue rupture at higher intensities of blue light. The simple and flexible technique enables non-invasive continuous dynamic imaging of highly photosensitive organisms with sizes between 1 mm3 and 5 cm3, up to eight hours, at high temporal resolution, on a scale from multiple polyps down to cellular resolution. This live imaging tool opens a new window into the dynamics of reef-building corals.

Abstract Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) is a popular modality to create additional contrast in fluorescence images. By carefully analyzing pixel-based nanosecond lifetime patterns, FLIM allows studying complex molecular populations. At the single molecule or single particle level, however, image series often suffer from low signal intensities per pixel, rendering it difficult to quantitatively disentangle different lifetime species, such as during FRET analysis in the presence of a significant donor-only fraction. To address this problem, we combined particle localization with phasor-based FLIM analysis. Using simulations, we first showed that an average of ∼300 photons, spread over the different pixels encompassing single fluorescing particles and without background, is enough to determine a correct phasor signature (standard deviation <5% for a 4 ns lifetime). For immobilized single- or double-labeled dsDNA molecules, we next validated that particle-based phasor-FLIM-FRET readily allows estimating fluorescence lifetimes and FRET from single molecules. Thirdly, we applied particle-based phasor-FLIM-FRET to investigate protein-protein interactions in sub diffraction HIV-1 viral particles. To do this, we first quantitatively compared the fluorescence brightness, lifetime and photostability of different popular fluorescent protein-based FRET probes when genetically fused to the HIV-1 integrase enzyme (IN) in viral particles, and conclude that eGFP, mTurquoise2 and mScarlet perform best. Finally, for viral particles co-expressing FRET-donor/acceptor labeled IN, we determined the absolute FRET efficiency of IN oligomers. Available in a convenient open-source graphical user interface, we believe that particle-based phasor-FLIM-FRET is a promising tool to provide detailed insights in samples suffering from low overall signal intensities. Why it matters Phasor-FLIM is an extraordinarily popular tool for fluorescence lifetime imaging analysis. However, it remains susceptible for low signal intensities, operational challenges and therefore required informed users and a clear analysis understanding. In this work we developed a convenient all-graphical workflow for quantitative phasor-FLIM in heterogenous and low-signal samples and applied it to quantifying absolute FRET efficiencies from protein-protein interactions inside single viral particles. Moreover, containing a well-illustrated theoretical introduction to time-domain phasor-FLIM, our paper helps novice users to correctly implement phasor-FLIM in standard microscopy practice.