Interleukin-21 (IL-21) is a pleiotropic cytokine that induces expression of transcription factor BLIMP1 (encoded by Prdm1), which regulates plasma cell differentiation and T cell homeostasis. We identified an IL-21 response element downstream of Prdm1 that binds the transcription factors STAT3 and IRF4, which are required for optimal Prdm1 expression. Genome-wide ChIP-Seq mapping of STAT3- and IRF4-binding sites showed that most regions with IL-21-induced STAT3 binding also bound IRF4 in vivo and furthermore revealed that the noncanonical TTCnnnTAA GAS motif critical in Prdm1 was broadly used for STAT3 binding. Comparing genome-wide expression array data to binding sites revealed that most IL-21-regulated genes were associated with combined STAT3-IRF4 sites rather than pure STAT3 sites. Correspondingly, ChIP-Seq analysis of Irf4−/− T cells showed greatly diminished STAT3 binding after IL-21 treatment, and Irf4−/− mice showed impaired IL-21-induced Tfh cell differentiation in vivo. These results reveal broad cooperative gene regulation by STAT3 and IRF4.

Summary The IL-2 receptor α-chain (IL-2Rα/CD25) is constitutively expressed on DN2/DN3 thymocytes and Treg cells but induced by IL-2 on mature T and NK cells. Il2ra expression is regulated by a super-enhancer extensively bound by STAT5 in mature T cells. Here, we demonstrate that STAT5 cooperates with Notch to induce/maintain Il2ra/ CD25 expression in DN2/DN3 cells. Moreover, we systematically investigated CD25 regulation using a series of mice with deletions spanning STAT5 binding elements. Deleting the upstream super-enhancer region mainly affected constitutive CD25 expression on DN2/DN3 thymocytes and Tregs, whereas deleting an intronic region primarily decreased IL-2-induced CD25 on peripheral T and NK cells. Thus, distinct elements preferentially control constitutive versus inducible expression in a cell-type-specific manner, with the MED1 coactivator co-localizing with specific STAT5 binding sites. Moreover, the intronic region was a dominant element whose deletion altered the structure throughout the super-enhancer in mature T cells. These results demonstrate differential functions for distinct super-enhancer elements, thereby indicating ways to manipulate CD25 expression in a cell-type specific fashion.

Abstract Transcription factor partners can cooperatively bind to DNA composite elements to augment gene transcription. Here, we report a novel protein-DNA binding screening pipeline, termed Spacing Preference Identification of Composite Elements (SPICE), that can systematically predict protein binding partners and DNA motif spacing preferences. SPICE de novo predicted known composite elements, including AP1-IRF composite elements (AICE) and STAT5 tetramers, and also predicted a range of novel binding partners, including JUN-IKZF1 composite elements, including at an upstream conserved noncoding region, CNS9, in the human IL10 gene, which contains a non-canonical IKZF1 site. We confirmed cooperative binding of JUN and IKZF1 and showed that the activity of an IL10 -luciferase reporter construct in primary B and T cells depended on both this site and the AP1 binding site within this composite element. Overall, our findings reveal an unappreciated global association of IKZF1 and AP1 and establish SPICE as a valuable new pipeline for predicting novel transcription binding complexes.

Abstract High frequencies of stem-like memory T cells in infusion products correlate with superior patient outcomes across multiple T cell therapy trials. Herein, we analyzed a published CRISPR activation screening to identify transcriptional regulators that could be harnessed to augment stem-like behavior in CD8 + T cells. Using IFN-γ production as a proxy for CD8 + T cell terminal differentiation, LMO4 emerged among the top hits inhibiting the development of effectors cells. Consistently, we found that Lmo4 was downregulated upon CD8 + T cell activation but maintained under culture conditions facilitating the formation of stem-like T cells. By employing a synthetic biology approach to ectopically express LMO4 in antitumor CD8 + T cells, we enabled selective expansion and enhanced persistence of transduced cells, while limiting their terminal differentiation and senescence. LMO4 overexpression promoted transcriptional programs regulating stemness, increasing the numbers of stem-like CD8 + memory T cells and enhancing their polyfunctionality and recall capacity. When tested in syngeneic and xenograft tumor models, LMO4 overexpression boosted CD8 + T cell antitumor immunity, resulting in enhanced tumor regression. Rather than directly modulating gene transcription, LMO4 bound to JAK1 and potentiated STAT3 signaling in response to IL-21, inducing the expression of target genes ( Tcf7 , Socs3 , Junb , and Zfp36 ) crucial for memory responses. CRISPR/Cas9-deletion of Stat3 nullified the enhanced memory signature conferred by LMO4, thereby abrogating the therapeutic benefit of LMO4 overexpression. These results establish LMO4 overexpression as an effective strategy to boost CD8 + T cell stemness, providing a new synthetic biology tool to bolster the efficacy of T cell-based immunotherapies.