Abstract Bacterial LPS induces rapid thrombocytopenia, hypotension, and sepsis. Although growing evidence suggests that platelet activation plays a critical role in LPS-induced thrombocytopenia and tissue damage, the mechanism of LPS-mediated platelet activation is unclear. In this study, we show that LPS stimulates platelet secretion of dense and α granules as indicated by ATP release and P-selectin expression, and thus enhances platelet activation induced by low concentrations of platelet agonists. Platelets express components of the LPS receptor-signaling complex, including TLR (TLR4), CD14, MD2, and MyD88, and the effect of LPS on platelet activation was abolished by an anti-TLR4-blocking Ab or TLR4 knockout, suggesting that the effect of LPS on platelet aggregation requires the TLR4 pathway. Furthermore, LPS-potentiated thrombin- and collagen-induced platelet aggregation and FeCl3-induced thrombus formation were abolished in MyD88 knockout mice. LPS also induced cGMP elevation and the stimulatory effect of LPS on platelet aggregation was abolished by inhibitors of NO synthase and the cGMP-dependent protein kinase (PKG). LPS-induced cGMP elevation was inhibited by an anti-TLR4 Ab or by TLR4 deficiency, suggesting that activation of the cGMP/protein kinase G pathway by LPS involves the TLR4 pathway. Taken together, our data indicate that LPS stimulates platelet secretion and potentiates platelet aggregation through a TLR4/MyD88- and cGMP/PKG-dependent pathway.

ABSTRACT CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) and its chemokine ligand CXCL12 are crucial to embryonic development, bone marrow retention of hematopoietic progenitor cells, cancer metastasis, angiogenesis and HIV-1 infection. Yet the structural basis for CXCR4 recognition of full-length CXCL12 remains unknown despite available structures of CXCR4 in complex with small molecule antagonists and a viral chemokine. Here we present a cryo-EM structure of monomeric CXCL12-CXCR4 in complex with heterotrimeric Gi proteins at a resolution of 2.65 Å. The CXCL12-CXCR4 interaction at their N termini is stabilized by a polar interaction between the PC motif (C28 NT in CXCR4) and CXC motif (the unique P10 in CXCL12). The N terminal 8 amino acids in CXCL12 insert into the transmembrane binding pocket (chemokine recognition site 2, CRS2) of CXCR4 with S4 defining an upward turn of V3, P2 and K1. Polar interactions involving C186 ECL2 and D187 ECL2 , along with hydrogen bonding with E288 7,39 and D262 6,58 stabilize the N terminus of CXCL12 in CRS2. Hydrophobic interactions between side chains aligning CRS2 and P2, L5 and S6 of CXCL12 further strengthen its binding to the receptor. CXCL12 inserts deep into the binding pocket, and the 3.2Å distance measured between V3 and the ‘toggle switch’ W 6.48 for G protein activation is among the shortest of all chemokine-receptor pairs. Our findings provide structural insights into the recognition mechanism of CXCR4 for its chemokine ligand CXCL12.

CXCR4 binding of its endogenous agonist CXCL12 leads to diverse functions, including bone marrow retention of hematopoietic progenitors and cancer metastasis. However, the structure of the CXCL12-bound CXCR4 remains unresolved despite available structures of CXCR4 in complex with antagonists. Here, we present the cryoelectron microscopy (cryo-EM) structure of the CXCL12-CXCR4-Gi complex at an overall resolution of 2.65 Å. CXCL12 forms a 1:1 stoichiometry complex with CXCR4, following the two-site model. The first 8 amino acids of mature CXCL12 are crucial for CXCR4 activation by forming polar interactions with minor sub-pocket residues in the transmembrane binding pocket. The 3.2-Å distance between V3 of CXCL12 and the "toggle switch" W6.48 marks the deepest insertion among all chemokine-receptor pairs, leading to conformational changes of CXCR4 for G protein activation. These results, combined with functional assays and computational analysis, provide the structural basis for CXCR4 activation by CXCL12.

ABSTRACT Chemerin is an adipokine with chemotactic activity to a subset of leukocytes. Chemerin mainly acts through its C-terminal nonapeptide (YFPGQFAFS, C9) that bind to three G protein-coupled receptors including chemokine-like receptor 1 (CMKLR1), G-protein coupled receptor 1 (GPR1) and C-C chemokine receptor-like 2 (CCRL2). We examined C9 signaling through GPR1 and found this receptor capable of Gi signaling but very weak β-arrestin signaling. Here we report high-resolution cryo-EM structures of GPR1-Gi complexes bound to full-length chemerin and to C9, respectively. Unlike C9 that inserts directly into a transmembrane binding pocket, full-length chemerin uses its N-terminal globular core for extensive interaction with the N terminus of GPR1. Within the binding pocket, the C terminal loop containing the nonapeptide takes the same “S-shape” pose as synthetic C9 nonapeptide. These findings explain why the nonapeptide is a full agonist of GPR1, and demonstrate that chemerin uses a “two-site” model for interaction with GPR1. An analysis of the GPR1-Gi protein interface found high similarities to the CMKLR1-Gi complex, as confirmed by site-directed mutagenesis with functional verifications. Our structural analysis demonstrates shared features with chemokines in that chemerin acts as a “reverse chemokine” with switched functions of its N and C termini in the interaction with GPR1.

ABSTRACT EROS (essential for reactive oxygen species) is a recently identified molecular chaperone of NOX2 (gp91 phox ), the catalytic subunit of phagocyte NADPH oxidase. Deficiency in NOX2 expression or function due to genetic mutations leads to chronic granulomatous disease (CGD) with recurrent bacterial and fungal infections. To delineate how EROS interacts with NOX2, we solved the cryo-EM structure of the EROS-NOX2-p22 phox heterotrimeric complex. EROS binds to NOX2 in plasma membrane through its anti-parallel α-helices H1 and H2, and in cytoplasm through multiple β-strands that form hydrogen bonds with the C terminal fragment of NOX2. EROS binding alters the conformation of the TM2 and TM6 transmembrane helices, increases the distance between the two hemes, and causes dislocation of the binding site for flavin adenine dinucleotide (FAD). EROS colocalizes with NOX2 on cell surface of neutrophil-like HL-60 cells and forms a heterotrimer with mature NOX2-p22 phox in transfected cells. Phorbol myristate acetate, an activator of NOX2, induces dissociation of EROS from NOX2 in a NanoLuc complementation assay with concurrent production of superoxide in reconstituted cells. Taken together, these findings provide a structural basis for EROS-NOX2 interaction and suggest a previously unidentified function of EROS in regulating NOX2 activation.

Essential for reactive oxygen species (EROS) protein is a recently identified molecular chaperone of NOX2 (gp91 phox ), the catalytic subunit of phagocyte NADPH oxidase. Deficiency in EROS is a recently identified cause for chronic granulomatous disease, a genetic disorder with recurrent bacterial and fungal infections. Here, we report a cryo-EM structure of the EROS–NOX2–p22 phox heterotrimeric complex at an overall resolution of 3.56Å. EROS and p22 phox are situated on the opposite sides of NOX2, and there is no direct contact between them. EROS associates with NOX2 through two antiparallel transmembrane (TM) α-helices and multiple β-strands that form hydrogen bonds with the cytoplasmic domain of NOX2. EROS binding induces a 79° upward bend of TM2 and a 48° backward rotation of the lower part of TM6 in NOX2, resulting in an increase in the distance between the two hemes and a shift of the binding site for flavin adenine dinucleotide (FAD). These conformational changes are expected to compromise superoxide production by NOX2, suggesting that the EROS-bound NOX2 is in a protected state against activation. Phorbol myristate acetate, an activator of NOX2 in vitro, is able to induce dissociation of NOX2 from EROS with concurrent increase in FAD binding and superoxide production in a transfected COS-7 model. In differentiated neutrophil-like HL-60, the majority of NOX2 on the cell surface is dissociated with EROS. Further studies are required to delineate how EROS dissociates from NOX2 during its transport to cell surface, which may be a potential mechanism for regulation of NOX2 activation.

Chemerin, a chemotactic adipokine, plays essential roles in adipogenesis and inflammation. Serum chemerin concentration is closely associated with obesity and metabolism disorders. The mature form of chemerin (residues 21-157) acts primarily through chemerin receptor 1 (CMKLR1) for transmembrane signaling. As a result, CMKLR1 serves as a promising target for therapeutic intervention of immunometabolic diseases such as diabetes and multiple sclerosis. Here, we present a high-resolution cryo-EM structure of CMKLR1-Gi signaling complex bound to biologically active full-length chemerin. The mature chemerin shows binding features distinct from its C-terminal nonapeptide including interaction with both the extracellular loops (ECLs) and the N-terminus of CMKLR1. Combining results from functional assays, our studies demonstrate that chemerin interacts with CMKLR1 in a "two-site" mode similar to chemokine-chemokine receptor interactions, but acting as a "reverse chemokine" by inserting its C-terminus instead of the N-terminus as in the case of chemokines into the transmembrane binding pocket of CMKLR1. These structural insights are expected to help develop synthetic analogs with therapeutic potential. A high-resolution cryo-EM structure of the CMKLR1-Gi signaling complex bound to full-length chemerin reveals its unique binding mechanism that is distinct from chemokine-chemokine receptor interactions.

ABSTRACT Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) encodes a viral G protein-coupled receptor, KSHV-GPCR, that contributes to KSHV immune evasion and pathogenesis of Kaposi’s Sarcoma. KSHV-GPCR shares a high similarity with CXC chemokine receptors CXCR2 and can be activated by selected chemokine ligands. KSHV-GPCR is also unique for its constitutive activity by coupling to various G proteins. We investigated the structural basis of ligand-dependent as well as constitutive activity of KSHV-GPCR through cryo-EM structural determination of KSHV-GPCR-Gi signaling complexes with and without bound CXCL1 chemokine ligand. Analysis of the apo-KSHV-GPCR-Gi structure, with an overall resolution of 2.81 Å, unraveled the involvement of extracellular loop 2 in constitutive activation of the receptor. This and other structural motifs serve to stabilize the constitutively-active KSHV-GPCR. The CXCL1-bound KSHV-GPCR-Gi structure was solved to an overall resolution of 3.01 Å, and showed a two-site binding of the chemokine by the receptor. Together with functional validations, this work shed light on the structural basis for constitutive as well as CXCL1-induced activation of KSHV-GPCR. The work also demonstrates evolutionary advantage in immune evasion by KSHV through its virally encoded chemokine receptor, with potential implications in developing therapeutic strategies for KSHV infection.