Significance A key question in structural biology is how protein properties mapped out under simplified conditions in vitro transfer to the complex environment in live cells. The answer, it appears, varies. Defying predictions from steric crowding effects, experimental data have shown that cells in some cases stabilize and in other cases destabilize the native protein structures. In this study, we reconcile these seemingly conflicting results by showing that the in-cell effect on protein thermodynamics is sequence specific: The outcome depends both on the individual target protein and on its detailed host-cell environment.

Background Hormone-sensitive lipase (HSL) is a key enzyme in the mobilization of fatty acids from stored triacylglycerols. Its activity is regulated by reversible protein phosphorylation. In rat HSL Ser563, Ser659 and Ser660 have been shown to be phosphorylated by protein kinase A (PKA) in vitro as well as in vivo. Methodology/Principal Findings In this study we employed site-directed mutagenesis, in vitro phosphorylation and mass spectrometry to show that in vitro phosphorylation of human HSL by PKA occurs primarily on Ser649 and Ser650 (Ser659 and Ser660 in rat HSL). The wild type enzyme and four mutants were expressed in C-terminally His-tagged form in Sf9 insect cells and purified to homogeneity. HSL variants in which Ser552 and/or Ser554 were mutated to Ala or Glu retained both lipolytic and non-lipolytic activity and were phosphorylated by PKA and activated to a similar extent as the wild type enzyme. 32P-labeling studies revealed that the bulk of the phosphorylation was on the Ser649/Ser650 site, with only a minor phosphorylation of Ser552 and Ser554. MS/MS analysis demonstrated that the peptide containing Ser649 and Ser650 was primarily phosphorylated on Ser650. The mutant lacking all four serines had severely reduced lipolytic activity, but a lesser reduction in non-lipolytic activity, had S0.5 values for p-nitrophenol butyrate and triolein comparable to those of wild type HSL and was not phosphorylated by PKA. PKA phosphorylation of the wild type enzyme resulted in an increase in both the maximum turnover and S0,5 using the TO substrate. Conclusions Our results demonstrate that PKA activates human HSL against lipid substrates in vitro primarily through phosphorylation of Ser649 and Ser650. In addition the results suggest that Ser649 and Ser650 are located in the vicinity of a lipid binding region and that PKA phosphorylation controls the accessibility of this region.

Hormone-sensitive lipase (EC 3.1.1.79; HSL) is a key enzyme in the mobilization of fatty acids from stored triacylglycerols. HSL activity is controlled by phosphorylation of at least four serines. In rat HSL, Ser563, Ser659 and Ser660 are phosphorylated by protein kinase A (PKA) in vitro as well as in vivo, and Ser660 and Ser659 have been shown to be the activity-controlling sites in vitro. The exact molecular events of PKA-mediated activation of HSL in vitro are yet to be determined, but increases in both Vmax and S0.5 seem to be involved, as recently shown for human HSL. In this study, the hydrophobic fluorescent probe 4,4'-dianilino-1,1'-binaphthyl-5,5'-disulfonic acid (bis-ANS) was found to inhibit the hydrolysis of triolein by purified recombinant rat adipocyte HSL, with a decrease in the effect of bis-ANS upon PKA phosphorylation of HSL. The interaction of HSL with bis-ANS was found to have a Kd of 1 microM in binding assays. Upon PKA phosphorylation, the interactions of HSL with both bis-ANS and the alternative probe SYPRO Orange were increased. By negative stain transmission electron microscopy, phosphorylated HSL was found to have a closer interaction with phospholipid vesicles than unphosphorylated HSL. Taken together, our results show that HSL increases its hydrophobic nature upon phosphorylation by PKA. This suggests that PKA phosphorylation induces a conformational change that increases the exposed hydrophobic surface and thereby facilitates binding of HSL to the lipid substrate.

NrdR is a bacterial transcriptional repressor consisting of a Zn-ribbon domain followed by an ATP-cone domain. Understanding its mechanism of action could aid the design of novel antibacterials. NrdR binds specifically to two "NrdR boxes" upstream of ribonucleotide reductase operons, of which Escherichia coli has three: nrdHIEF, nrdDG and nrdAB, where we identified a new box. We show that E. coli NrdR (EcoNrdR) has similar binding strength to all three sites when loaded with ATP plus dATP or equivalent diphosphate combinations. No other combination of nucleotides promotes binding to DNA. We present crystal structures of EcoNrdR-ATP-dATP and EcoNrdR-ADP-dATP, which are the first high resolution crystal structures of an NrdR. We have also determined cryo-EM structures of DNA-bound EcoNrdRATP-dATP and novel filaments of EcoNrdR-ATP. Tetrameric forms of EcoNrdR involve alternating interactions between pairs of Zn-ribbon domains and ATP-cones. The structures reveal considerable flexibility in relative orientation of ATP-cones vs Zn-ribbon domains. The structure of DNA-bound EcoNrdR-ATP-dATP shows that significant conformational rearrangements between ATP-cones and Zn-ribbons accompany DNA binding while the ATPcones retain the same relative orientation. In contrast, ATP-loaded EcoNrdR filaments show rearrangements of the ATP-cone pairs and sequester the DNA-binding residues of NrdR such that they are unable to bind to DNA. Our results, in combination with a previous structural and biochemical study, point to highly flexible EcoNrdR structures that when loaded with the correct nucleotides adapt to an optimal promoter binding conformation.

ABSTRACT The FragMAX facility at MAX IV Laboratory is a state‐of‐the‐art platform for crystallographic fragment screening, designed to support structure‐based drug and chemical tool compound discovery. This facility offers a comprehensive workflow, from high‐throughput crystal preparation and automated diffraction data collection at the BioMAX beamline to advanced data processing and analysis using custom software tools like FragMAXapp and FragMAXproc. Key components include an extensive relational SQLite database, various fragment libraries, laboratory automation equipment, and a range of bespoke software solutions. FragMAX has conducted numerous successful screening campaigns, serving both academic and industrial users. Users benefit from comprehensive support, and stringent data management. Here, we provide an overview of the different components of the facility and details of their practical implementation.

Ribonucleotide reductases (RNRs) are key enzymes in DNA synthesis and repair, with sophisticated allosteric mechanisms controlling both substrate specificity and overall activity. In RNRs, the activity master-switch, the ATP-cone, has been found exclusively in the catalytic subunit. In two class I RNR subclasses whose catalytic subunit lacks the ATP-cone, we discovered ATP-cones in the radical-generating subunit. The ATP-cone in the Leewenhoekiella blandensis radical-generating subunit regulates activity via modifications of quaternary structure induced by binding of nucleotides. ATP induces enzymatically competent dimers, whereas dATP induces non-productive tetramers, resulting in different holoenzyme complexes. The tetramer forms solely by interactions between ATP-cones, as evidenced by a 2.45 Å crystal structure. We also present evidence for an MnIIIMnIV metal center. In summary, lack of an ATP-cone domain in the catalytic subunit was compensated by evolutionary capture of the domain by the radical-generating subunit. Our findings present a novel opportunity for dATP-regulation of engineered proteins.

Abstract A small, nucleotide-binding domain, the ATP-cone, is found at the N-terminus of most ribonucleotide reductase (RNR) catalytic subunits. By binding ATP or dATP it regulates the enzyme activity of all classes of RNR. Functional and structural work on aerobic RNRs has revealed a plethora of ways in which dATP inhibits activity by inducing oligomerization and preventing a productive radical transfer from one subunit to the active site in the other. Anaerobic RNRs, on the other hand, store a stable glycyl radical next to the active site and the basis for their dATP-dependent inhibition is completely unknown. We present biochemical, biophysical and structural information on the effects of ATP and dATP binding to the anaerobic RNR from Prevotella copri . The enzyme exists in a dimer-tetramer equilibrium biased towards dimers when two ATP molecules are bound to the ATP-cone and tetramers when two dATP molecules are bound. In the presence of ATP, P. copri NrdD is active and has a fully ordered glycyl radical domain (GRD) in one monomer of the dimer. Binding of dATP to the ATP-cone results in loss of activity and increased dynamics of the GRD, such that it can not be detected in the cryo-EM structures. The glycyl radical is formed even in the dATP-bound form, but the substrate does not bind. The structures implicate a complex network of interactions in activity regulation that involve the GRD more than 30 Å away from the dATP molecules, the allosteric substrate specificity site and a conserved but previously unseen flap over the active site. Taken together, the results suggest dATP inhibition in anaerobic RNRs acts by increasing the flexibility of the flap and GRD, thereby preventing both substrate binding and radical mobilisation.