ObjectiveVarious preparative protocols have been proposed for the acquisition and cultivation of mesenchymal stem cells (MSC). Whereas surface antigen markers have failed to precisely define this population, microarray analysis might provide a better tool for characterization of MSC.MethodsIn this study, we have analyzed global gene expression profiles of human MSC isolated from adipose tissue (AT), from umbilical cord blood (CB), and from bone marrow (BM) under two growth conditions and have compared them to terminally differentiated human fibroblasts (HS68). Profiles were compared using our Human Genome Microarray representing 51.144 different cDNA clones.ResultsCultured with the appropriate conditions, osteogenic and adipogenic differentiation could be confirmed in all MSC preparations but not in fibroblasts. No phenotypic differences were observed by flow cytometry using a panel of 22 surface antigen markers. Whereas MSC derived from different donors using the same culture procedure yielded a consistent and reproducible gene expression profile, many genes were differentially expressed in MSC from different ontogenetic sources or from different culture conditions. Twenty-five genes were overlapping and upregulated in all MSC preparations from AT, CB, and BM as compared to HS68 fibroblasts. These genes included fibronectin, ECM2, glypican-4, ID1, NF1B, HOXA5, and HOXB6. Many genes upregulated in MSC are involved in extracellular matrix, morphogenesis, and development, whereas several inhibitors of the Wnt pathway (DKK1, DKK3, SFRP1) were highly expressed in fibroblasts.ConclusionOur results have provided a foundation for a more reproducible and reliable quality control using genotypic analysis for defining MSC. Various preparative protocols have been proposed for the acquisition and cultivation of mesenchymal stem cells (MSC). Whereas surface antigen markers have failed to precisely define this population, microarray analysis might provide a better tool for characterization of MSC. In this study, we have analyzed global gene expression profiles of human MSC isolated from adipose tissue (AT), from umbilical cord blood (CB), and from bone marrow (BM) under two growth conditions and have compared them to terminally differentiated human fibroblasts (HS68). Profiles were compared using our Human Genome Microarray representing 51.144 different cDNA clones. Cultured with the appropriate conditions, osteogenic and adipogenic differentiation could be confirmed in all MSC preparations but not in fibroblasts. No phenotypic differences were observed by flow cytometry using a panel of 22 surface antigen markers. Whereas MSC derived from different donors using the same culture procedure yielded a consistent and reproducible gene expression profile, many genes were differentially expressed in MSC from different ontogenetic sources or from different culture conditions. Twenty-five genes were overlapping and upregulated in all MSC preparations from AT, CB, and BM as compared to HS68 fibroblasts. These genes included fibronectin, ECM2, glypican-4, ID1, NF1B, HOXA5, and HOXB6. Many genes upregulated in MSC are involved in extracellular matrix, morphogenesis, and development, whereas several inhibitors of the Wnt pathway (DKK1, DKK3, SFRP1) were highly expressed in fibroblasts. Our results have provided a foundation for a more reproducible and reliable quality control using genotypic analysis for defining MSC.

Mesenchymal stem cells (MSC) comprise a promising tool for cellular therapy. These cells are usually culture expanded prior to their application. However, a precise molecular definition of MSC and the sequel of long-term in vitro culture are yet unknown. In this study, we have addressed the impact of replicative senescence on human MSC preparations. Within 43 to 77 days of cultivation (7 to 12 passages), MSC demonstrated morphological abnormalities, enlargement, attenuated expression of specific surface markers, and ultimately proliferation arrest. Adipogenic differentiation potential decreased whereas the propensity for osteogenic differentiation increased. mRNA expression profiling revealed a consistent pattern of alterations in the global gene expression signature of MSC at different passages. These changes are not restricted to later passages, but are continuously acquired with increasing passages. Genes involved in cell cycle, DNA replication and DNA repair are significantly down-regulated in late passages. Genes from chromosome 4q21 were over-represented among differentially regulated transcripts. Differential expression of 10 genes has been verified in independent donor samples as well as in MSC that were isolated under different culture conditions. Furthermore, miRNA expression profiling revealed an up-regulation of hsa-mir-371, hsa-mir-369-5P, hsa-mir-29c, hsa-mir-499 and hsa-let-7f upon in vitro propagation. Our studies indicate that replicative senescence of MSC preparations is a continuous process starting from the first passage onwards. This process includes far reaching alterations in phenotype, differentiation potential, global gene expression patterns, and miRNA profiles that need to be considered for therapeutic application of MSC preparations.

The regenerative potential diminishes with age and this has been ascribed to functional impairments of adult stem cells. Cells in culture undergo senescence after a certain number of cell divisions whereby the cells enlarge and finally stop proliferation. This observation of replicative senescence has been extrapolated to somatic stem cells in vivo and might reflect the aging process of the whole organism. In this study we have analyzed the effect of aging on gene expression profiles of human mesenchymal stromal cells (MSC) and human hematopoietic progenitor cells (HPC). MSC were isolated from bone marrow of donors between 21 and 92 years old. 67 genes were age-induced and 60 were age-repressed. HPC were isolated from cord blood or from mobilized peripheral blood of donors between 27 and 73 years and 432 genes were age-induced and 495 were age-repressed. The overlap of age-associated differential gene expression in HPC and MSC was moderate. However, it was striking that several age-related gene expression changes in both MSC and HPC were also differentially expressed upon replicative senescence of MSC in vitro. Especially genes involved in genomic integrity and regulation of transcription were age-repressed. Although telomerase activity and telomere length varied in HPC particularly from older donors, an age-dependent decline was not significant arguing against telomere exhaustion as being causal for the aging phenotype. These studies have demonstrated that aging causes gene expression changes in human MSC and HPC that vary between the two different cell types. Changes upon aging of MSC and HPC are related to those of replicative senescence of MSC in vitro and this indicates that our stem and progenitor cells undergo a similar process also in vivo.

In glioma-in contrast to various other cancers-the impact of T-lymphocytes on clinical outcome is not clear. We investigated the clinical relevance and regulation of T-cell infiltration in glioma.T-cell subpopulations from entire sections of 93 WHO°II-IV gliomas were computationally identified using markers CD3, CD8, and Foxp3; survival analysis was then done on primary glioblastomas (pGBM). Endothelial cells expressing cellular adhesion molecules (CAM) were similarly computationally quantified from the same glioma tissues. Influence of prominent cytokines (as measured by ELISA from 53 WHO°II-IV glioma lysates) on CAM-expression in GBM-isolated endothelial cells was determined using flow cytometry. The functional relevance of the cytokine-mediated CAM regulation was tested in a transmigration assay using GBM-derived endothelial cells and autologous T-cells.Infiltration of all T-cell subsets increased in high-grade tumors. Most strikingly, within pGBM, elevated numbers of intratumoral effector T cells (T(eff), cytotoxic and helper) significantly correlated with a better survival; regulatory T cells were infrequently present and not associated with GBM patient outcome. Interestingly, increased infiltration of T(eff) cells was related to the expression of ICAM-1 on the vessel surface. Transmigration of autologous T cells in vitro was markedly reduced in the presence of CAM-blocking antibodies. We found that TGF-β molecules impeded transmigration and downregulated CAM-expression on GBM-isolated endothelial cells; blocking TGF-β receptor signaling increased transmigration.This study provides comprehensive and novel insights into occurrence and regulation of T-cell infiltration in glioma. Specifically, targeting TGF-β1 and TGF-β2 might improve intratumoral T-cell infiltration and thus enhance effectiveness of immunotherapeutic approaches.

Stem-like tumor cells comprise a highly tumorigenic and therapy-resistant tumor subpopulation, which is believed to substantially influence tumor initiation and therapy resistance in glioma. Currently, therapeutic, drug-induced differentiation is considered as a promising approach to eradicate this tumor-driving cell population; retinoic acid is well known as a potent modulator of differentiation and proliferation in normal stem cells. In glioma, knowledge about the efficacy of retinoic acid-induced differentiation to target the stem-like tumor cell pool could have therapeutic implications.Stem-like glioma cells (SLGC) were differentiated with all-trans retinoic acid-containing medium to study the effect of differentiation on angiogenesis, invasive growth, as well as radioresistance and chemoresistance of SLGCs. In vivo effects were studied using live microscopy in a cranial window model.Our data suggest that in vitro differentiation of SLGCs induces therapy-sensitizing effects, impairs the secretion of angiogenic cytokines, and disrupts SLGCs motility. Further, ex vivo differentiation reduces tumorigenicity of SLGCs. Finally, we show that all-trans retinoic acid treatment alone can induce antitumor effects in vivo.Altogether, these results highlight the potential of differentiation treatment to target the stem-like cell population in glioblastoma.

Abstract Although T-cell-engaging therapies are highly effective in patients with relapsed and/or refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma (B-NHL), responses are often not durable. To identify tumor-intrinsic drivers of resistance, we quantified in-vitro response to CD19-directed chimeric antigen receptor T-cells (CD19-CAR) and bispecific antibodies (BsAb) across 46 B-NHL cell lines and measured their proteomic profiles at baseline. Among the proteins associated with poor in-vitro response was Serpin B9, an endogenous granzyme B inhibitor. Knock-out of SERPINB9 in cell lines with high intrinsic expression rendered them more susceptible to CD19-CAR and CD19-BsAb. Overexpression in cell lines with low intrinsic expression attenuated responses. Polatuzumab, vorinostat, lenalidomide, or checkpoint inhibitors improved response to CD19-CAR, although independently of Serpin B9 expression. Besides providing an important resource of therapy response and proteomic profiles, this study refines our understanding of resistance in T-cell engaging therapies, and suggests clinically relevant combination regimes.