Abstract P4-ATPases flip lipids from the exoplasmic to the cytosolic leaflet, thus maintaining lipid asymmetry in eukaryotic cell membranes. Mutations in several human P4-ATPase genes are associated with severe diseases, e.g. in ATP8B1 causing progressive familial intrahepatic cholestasis, a rare inherited disorder progressing toward liver failure. ATP8B1 forms a binary complex with CDC50A and displays a broad specificity to glycerophospholipids, but regulatory mechanisms are unknown. Here, we report functional studies and the cryo-EM structure of the human lipid flippase ATP8B1-CDC50A at 3.1 Å resolution. We find that ATP8B1 is autoinhibited by its N- and C-terminal tails, which form extensive interactions with the catalytic sites and flexible domain interfaces. Consistently, ATP hydrolysis is unleashed by truncation of the C-terminus, but also requires phosphoinositides, most markedly phosphatidylinositol-3,4,5-phosphate (PI(3,4,5)P 3 ), and removal of both N- and C- termini results in full activation. Restored inhibition of ATP8B1 truncation constructs with a synthetic peptide mimicking the C-terminal segment further suggests molecular communication between N- and C-termini in the autoinhibition and demonstrates that the regulatory mechanism can be interfered with by exogenous compounds. A recurring (G/A)(Y/F)AFS motif of the C-terminal segment suggests that this mechanism is employed widely across P4-ATPase lipid flippases in plasma membrane and endomembranes.

Active nutrient uptake is fundamental for survival and pathogenicity of Gram-negative bacteria, which operate a multi-protein Ton system to transport essential nutrients like metals and vitamins. This system harnesses the proton motive force at the inner membrane to energize the import through the outer membrane, but the mechanism of energy transfer remains enigmatic. Here, we study the periplasmic domain of ExbD, a crucial component of the proton channel of the Ton system. We show that this domain is a dynamic dimer switching between two conformations representing the proton channel's open and closed states. By

Abstract Despite extensive characterisation of envelope biogenesis systems in diderm bacteria, glycerophospholipid (GPL) trafficking remains poorly understood, and has only been studied in a handful of model species. Within the Proteobacteria, the maintenance of lipid asymmetry (Mla) system facilitates retrograde GPL trafficking via six proteins, MlaA-F. GPLs are extracted from the outer leaflet of the outer membrane by the lipoprotein MlaA which associates with porin trimers, then shipped through the periplasmic space by the chaperone MlaC, which finally delivers GPLs to the inner membrane complex formed by MlaBDEF. Here, we investigate GPL trafficking in Veillonella parvula , a diderm member of the Firmicutes which encodes an Mla system devoid of MlaA and MlaC. V. parvula Δ mla mutants display phenotypes characteristic of disrupted lipid asymmetry such as hypervesiculation and detergent hypersensitivity, and lipid content analysis from outer membrane vesicles reveals an enrichment for the major lipid component phosphatidylethanolamine. Interestingly, suppressor analysis identifies mutations in tamB that rescue detergent hypersensitivity and hypervesiculation of Δ mla strains, supporting the involvement of these two systems in antagonistic GPL trafficking functions across diverse bacterial lineages. A combination of structural modeling and subcellular localisation assays shows that MlaD Vp is longer than in classical diderm models and forms a transenvelope bridge, encoding both an inner membrane-localised MCE domain and an outer membrane ß-barrel. These results strongly suggest that V. parvula possesses a minimal Mla system for GPL trafficking, replacing the need for chaperones and outer membrane lipoproteins by directly connecting the two membranes. Finally, phylogenomic analysis indicates that this MlaEFD self-contained architecture is widely distributed in diderm bacteria and most likely represents the ancestral functional core of the Mla system, which subsequently increased in complexity in Proteobacteria and closely related phyla following the emergence of MlaABC. Our work broadens the diversity of current models of GPL trafficking in diderm bacteria, challenging the paradigm set by classical models and shedding light on the evolution of a crucial system in the biogenesis and maintenance of the bacterial outer membrane.

Abstract The envelope of Gram-negative bacteria is composed of a double membrane separated by the periplasmic space. This organization imposes geometrical and distance constraints that are key for the mechanism of action of multicomponent systems spanning the envelope. However, consideration of all three compartments by experimental approaches is still elusive. Here we used the state-of-the-art molecular dynamics simulation in an Escherichia coli envelope model to obtain a dynamic view of molecular interactions between the outer membrane heme transporter HasR and the inner membrane TonB-like protein HasB. Their interaction allows the transfer of the inner membrane proton motive force derived energy to the transporter for heme internalization. The simulations which incorporate both membranes show the key role of periplasmic domains of both proteins, and their dynamics in the complex formation and stability. They revealed a previously unidentified atomic network of interactions, as well as the sequences of the interactions and their variations with the presence of external substrates. Experimental validation (mutations, phenotypic and in vitro assays) confirms the robustness of our approach and provides verification of the simulation-predicted interactions. Based on structural and sequence conservation, the network of interaction revealed in this study is expected to occur in other nutrient import systems. The integrative approach presented here is highly useful to study the dynamic interplay between components of any other bacterial transmembrane systems.