Platelets play a critical role in maintaining vascular integrity during inflammation, but little is known about the underlying molecular mechanisms. Here we report that platelet immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM) signaling, but not GPCR signaling, is critical for the prevention of inflammation-induced hemorrhage. To generate mice with partial or complete defects in these signaling pathways, we developed a protocol for adoptive transfer of genetically and/or chemically inhibited platelets into thrombocytopenic (TP) mice. Unexpectedly, platelets with impaired GPCR signaling, a crucial component of platelet plug formation and hemostasis, were indistinguishable from WT platelets in their ability to prevent hemorrhage at sites of inflammation. In contrast, inhibition of GPVI or genetic deletion of Clec2, the only ITAM receptors expressed on mouse platelets, significantly reduced the ability of platelets to prevent inflammation-induced hemorrhage. Moreover, transfusion of platelets without ITAM receptor function or platelets lacking the adapter protein SLP-76 into TP mice had no significant effect on vascular integrity during inflammation. These results indicate that the control of vascular integrity is a major function of immune-type receptors in platelets, highlighting a potential clinical complication of novel antithrombotic agents directed toward the ITAM signaling pathway.

ABSTRACT Myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury and the resulting cardiac remodeling is a common cause of heart failure. The RNA binding protein Human Antigen R (HuR) has been previously shown to reduce cardiac remodeling following both I/R and cardiac pressure overload, but the full extent of the HuR-dependent mechanisms within cells of the myocardium have yet to be elucidated. In this study, we applied a novel small molecule inhibitor of HuR to define the functional role of HuR in the acute response to I/R injury and gain a better understanding of the HuR-dependent mechanisms during post-ischemic myocardial remodeling. Our results show an early (two hours post-I/R) increase in HuR activity that is necessary for early inflammatory gene expression by cardiomyocytes in response to I/R. Surprisingly, despite the reductions in early inflammatory gene expression at two hours post-I/R, HuR inhibition has no effect on initial infarct size at 24-hours post-I/R. However, in agreement with previously published work, we do see a reduction in pathological remodeling and preserved cardiac function at two weeks post-I/R upon HuR inhibition. RNA-sequencing analysis of neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) at two hours post-LPS treatment to model damage associated molecular pattern (DAMP)-mediated activation of toll like receptors (TLRs) demonstrates a broad HuR-dependent regulation of pro-inflammatory chemokine and cytokine gene expression in cardiomyocytes. We show that conditioned media from NRVMs pre-treated with HuR inhibitor loses the ability to induce inflammatory gene expression in bone marrow derived macrophages (BMDMs) compared to NRVMs treated with LPS alone. Functionally, HuR inhibition in NRVMs also reduces their ability to induce endocrine migration of peripheral blood monocytes in vitro and reduces post-ischemic macrophage infiltration to the heart in vivo. In summary, these results suggest a HuR-dependent expression of pro-inflammatory gene expression by cardiomyocytes that leads to subsequent monocyte recruitment and macrophage activation in the post-ischemic myocardium.

Background: Transforming growth factor beta (TGFβ) blockade via systemic antibody targeting has been shown to augment murine AAA progression in multiple independent studies. Despite these findings, the primary source of protective TGFβ within AAA remains unclear. Previous research conducted in our laboratory demonstrates deletion of platelet-specific TGFβ1 exacerbates aneurysms in the elastase mouse model of AAA. Our present study extends these results by showing a comparable phenotype in the angiotensin II (Ang II) murine model of AAA. Methods and Results: Low density lipoprotein receptor deficient ( Ldlr -/- ) mice with platelet-specific deletion of Tgfβ1 were created by breeding male mice expressing Cre recombinase under the control of a Pf4 promoter to female Tgfβ1 floxed mice (Jackson Labs). Male mice were fed high fat diet 1 week prior to and throughout subcutaneous infusion of AngII (1,000 ng/kg/min). After day 28 of infusion, ex vivo aortic diameter was significantly increased in Cre+ (n = 17) vs Cre- (n = 18) mice ( Cre- : 1.75 ± 0.17 mm; Cre+ : 2.43 ± 0.21 mm; P < 0.05). AAA incidence, defined as aortic diameter ≥ 1.2mm, was 56% for Cre- mice vs. 93% in the Cre+ group. Histological analysis of picrosirius red staining revealed a marked reduction in type 1 abdominal collagen deposition as a proportion of total cellular area in aortas from Cre+ mice versus Cre- controls. OCT embedded sections of aneurysms from both cohorts were also probed for macrophage marker CD68 and analyzed using immunofluorescent microscopy. We found Cre+ aortas had significantly increased macrophage infiltration compared to Cre- aortas. Conclusions: This study of platelet-specific deletion of TGFβ1 in a secondary model of murine AAA supports the conclusion that TGFβ1 sourced form platelets plays a critically important role in the protection of AAA.

Objective: Lineage tracing studies have shown that advanced atherosclerosis causes vascular smooth muscle cells (VSMCs) to become macrophage-like (MLCs), which increases inflammation. We investigated whether the RNA binding protein human antigen R (HuR) and the inflammatory receptor protease activated receptor 2 (PAR2) accelerate VSMC-MLC in a mouse model of atherosclerosis. Methods and Results: Downregulation of VSMC migration and cytokine release in Par2 -/- mice reduces atherosclerotic lesion area compared to proficient controls. To examine the role of PAR2 in the VSMC-MLC dedifferentiation, Par2 +/+ and Par2 -/- VSMCs were treated with 10μg/mL methyl-β-cyclodextrin cholesterol for 72 hours. While Par2 +/+ VSMCs demonstrated a loss of VSMCs markers and upregulated macrophage markers, Par2 -/- VSMCs remained stable. When comparing 101 mice strains with induced atherosclerosis, PAR2 was significantly correlated with Krüppel-like factor 4 (KLF4), a gene that regulates VSMC dedifferentiation. Also, Par2-/- VSMCs had lower basal KLF4 expression. Previous studies have demonstrated PAR2 mRNA is bound and stabilized by the RNA binding protein HuR. Our studies confirm these findings where Par2 -/- VSMCs have less HuR mRNA expression, suggesting a role of HuR in PAR2 mRNA stability. Our studies have also demonstrated a dampening of HuR activation in Par2 -/- VSMCs, suggesting a potential feedforward mechanism between HuRs stabilizing capabilities of PAR2 mRNA and PAR2s presence necessary for HuR activation. To delineate the role of HuR in VSMC dedifferentiation and atherosclerosis, a HuR flox mouse line has been bred on to a SM22 Cre as well as a Myh11 Cre lineage tracing reporter line. To date, we have determined male and female Ldlr -/- HuR flox/flox SM22 Cre+ mice have attenuated atherosclerosis compared to their littermate Cre - controls at both 12 and 24 weeks. Conclusions: These results suggest that VSMC PAR2 activation mediates the dedifferentiation of VSMCs via KLF4 and subsequent binding by HuR, which stabilizes PAR2 mRNA and upregulates PAR2. We also have established a definitive role of VSMC HuR in the development of atherosclerosis. Future studies will continue to elucidate the specific role of HuR in VSMC dedifferentiation.

Introduction: Abdominal aortic aneurysms (AAA) are a pro-inflammatory disease that frequently feature a nonocclusive intraluminal thrombus (ILT) at the expansion site. Platelet abundance is notable at the luminal interface of an ILT, and recent investigations conducted by our lab and others elucidate the pivotal involvement of platelets activation and adhesion in the pathogenesis of AAA. While inflammation is recognized to affect platelet physiology, the impact of inflammation associated with AAA on the platelet phenotype remains unclear. Therefore, our objective was to elucidate the impact of AAA on platelet phenotype. Methods and Results: Male C57BL/6J mice underwent laparotomy and either a sterile solution of 10 mg/mL elastase solution (n =6) or heat inactivated (HI) elastase solution (n = 4), used as control, was applied to the infrarenal aorta. Weekly ultrasounds demonstrated that mice treated with elastase had significantly elevated aortic diameter and AAA incidence as compared to HI treated controls. Platelet counts and volumes were assessed weekly via a veterinary hematology analyzer. While there was no significant difference in mean platelet volume, platelet counts in AAA mice were on the lower end of the reference range, comparable to human AAA patients. At 4 weeks following laparotomy, platelets were isolated via terminal IVC blood collection, washed, and subjected to a dose response curve of both thrombin (protease-activated receptor agonist; 0.1 U/mL - 1 U/mL) and convulxin (glycoprotein VI agonist; 10 ng/mL - 100 ng/mL). Surface expression of P-selectin was the measured by flow cytometry. Platelets isolated from mice with aneurysms had greater surface P-selectin after agonist exposure compared to HI control platelets. Additionally, we reanalyzed published RNA sequencing data from control and AAA patient isolated platelets and found several upregulated platelet surface markers in AAA patients as compared to controls. Conclusions: Our data indicates that AAA influences platelet reactivity and modifies surface marker expression. While more work is needed to fully elucidate the underlying mechanisms, our data has significant implications for understanding how systemic inflammatory diseases like AAA affects platelets.

Free fatty acid receptor 4 (FFAR4) has recently emerged as a target for preventing CVD through its ability to reduce macrophage foam cell formation and inflammation. We have shown that activation of FFAR4 by synthetic agonists decreases foam cell formation, whereas deficiency of FFAR4 increases foam cell formation. Building on these data, we hypothesized that FFAR4 would protect against atherosclerotic plaque formation in vivo . To test this hypothesis, we generated global FFAR4 knockout mice on an apoE-deficient background. Male and female apoE/FFAR4 double knockout mice (n=20) and their apoE knockout controls (n=20) were fed a Western diet (42% calories from fat and 0.2% cholesterol) for 16 weeks. We collected weekly body weights and fasting plasma samples from mice at 0, 8, and 16 weeks to measure triglyceride and cholesterol levels. At the end of the 16-week study, atherosclerotic plaque severity was determined by analyzing the aortic sinus lesion area of the heart and the en-face lesion area of the aortic arch. In both the male and female mice, we observed no differences in weekly body weights or lipid levels between the apoE knockout and apoE/FFAR4 double knockout mice. In our first cohort of male mice (n=10), the two genotypes showed no difference in the aortic sinus lesion area. However, male apoE/FFAR4 double knockout mice had a statistically significant (p=0.039) 1.4-fold increase in total aortic arch lesion area compared to FFAR4-deficient mice. While female mice (n=9) showed no differences in atherosclerotic plaque in the aortic sinus and aortic arch between the two genotypes, they did present with 1.7-fold (p=0.002) and 2-fold increases (p=0.009) in aortic sinus lesion area and aortic arch lesion area, respectively, as compared to male mice. Based on analysis of an initial set of mice, our data support a protective role for FFAR4 in the development of atherosclerotic plaque formation in male mice, and our findings may have uncovered a new therapeutic target against atherosclerosis.

Cardiovascular disease (CVD) is a significant burden globally and, despite current therapeutics, remains the leading cause of death. Platelet inhibitors are of interest in CVD treatment to reduce thrombus formation post-plaque rupture as well their contribution to inflammation throughout the progression of atherosclerosis. Protease activated receptor 4 (PAR4) is a receptor highly expressed by platelets, strongly activated by thrombin, and plays a vital role in platelet activation and aggregation. However, the role of PAR4.

ABSTRACT A common feature in patients with abdominal aortic aneurysms (AAA) is the formation of a nonocclusive intraluminal thrombus (ILT) in regions of aortic dilation. Platelets are known to maintain hemostasis and propagate thrombosis through several redundant activation mechanisms, yet the role of platelet activation in the pathogenesis of AAA associated ILT is still poorly understood. Thus, we sought to investigate how platelet activation impacts the pathogenesis of AAA. Using RNA-sequencing, we identify that the platelet-associated transcripts are significantly enriched in the ILT compared to the adjacent aneurysm wall and healthy control aortas. We found that the platelet specific receptor glycoprotein VI (GPVI) is among the top enriched genes in AAA ILT and is increased on the platelet surface of AAA patients. Examination of a specific indicator of platelet activity, soluble GPVI (sGPVI), in two independent AAA patient cohorts is highly predictive of a AAA diagnosis and associates more strongly with aneurysm growth rate when compared to D-dimer in humans. Finally, intervention with the anti-GPVI antibody (J) in mice with established aneurysms blunted the progression of AAA in two independent mouse models. In conclusion, we show that levels of sGPVI in humans can predict a diagnosis of AAA and AAA growth rate, which may be critical in the identification of high-risk patients. We also identify GPVI as a novel platelet-specific AAA therapeutic target, with minimal risk of adverse bleeding complications, where none currently exist. KEY POINTS Soluble glycoprotein VI, which is a platelet-derived blood biomarker, predicts a diagnosis of AAA, with high sensitivity and specificity in distinguishing patients with fast from slow-growing AAA. Blockade of glycoprotein VI in mice with established aneurysms reduces AAA progression and mortality, indicating therapeutic potential.

Introduction: Angina with non-obstructive coronary arteries (ANOCA) affects four million individuals in the U.S. and is associated with an economic burden that exceeds obstructive coronary artery disease (CAD). Sodium Glucose Cotransporter-2 Inhibitors (SGLT2i) are a novel class of glucose control medications initially indicated for use in type 2 diabetes that also reduce the risk major adverse cardiovascular events (MACE) in cardiovascular diseases. SGLT2i have recently been found to reduce the risk of MACE in patients with heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF), which shares a common pathophysiological mechanism (coronary microvascular dysfunction) to ANOCA. Here, we examined the effects of SGLT2i on symptoms in ANOCA patients. Methods: Utilizing the Women’s Heart Center (WHC) Registry, we conducted a retrospective chart review of ANOCA patients who previously underwent coronary functional testing (CFT), were prescribed SGL2i, and were assessed for follow-up within 6 months. All brands of SGLT2i (dapagliflozin and empagliflozin) were included and symptoms were assessed utilizing validated questionnaires (NYHA HF and CCS angina class) pre- and post-treatment. Results: Among 34 ANOCA patients who underwent CFT and were clinically treated with SGLT2i’s, 29 (88%) were female (mean age=60.2; SD=11.4) and median treatment duration was 276 days (IQR:151,531). At the time of CFT, 50% had diabetes, 68% had hypertension, 97% had dyslipidemia, and 26% had a history of obstructive CAD. Among ANOCA patients, there were significantly fewer patients reporting angina at CCS class of 3 or 4 (moderate or severe limitation) post SGLT2i treatment (McNemar’s Exact, p=0.039, Figure 1). Among ANOCA patients with contaminant HFpEF (N=15, 53%), there were significantly fewer patients reporting a functional impairment at NYHA class of III and IV (marked or severe limitation) post SGLT2i treatment (McNemar’s Exact, p=0.016). Conclusions: SGLT2i show potential for reducing angina in ANOCA patients and improving function in patients with both ANOCA and HFpEF. Together, these data suggest benefit of SGLT2i in ANOCA patients and future studies should examine the effect these drugs have on underlying mechanisms (CMD).

A common feature in patients with abdominal aortic aneurysms (AAA) is the formation of a nonocclusive intraluminal thrombus (ILT) in regions of aortic dilation. Platelets are known to maintain hemostasis and propagate thrombosis through several redundant activation mechanisms, yet the role of platelet activation in the pathogenesis of AAA associated ILT is still poorly understood. Thus, we sought to investigate how platelet activation impacts the pathogenesis of AAA. Using RNA-sequencing, we identify that the platelet-associated transcripts are significantly enriched in the ILT compared to the adjacent aneurysm wall and healthy control aortas. We found that the platelet specific receptor glycoprotein VI (GPVI) is among the top enriched genes in AAA ILT and is increased on the platelet surface of AAA patients. Examination of a specific indicator of platelet activity, soluble GPVI (sGPVI), in two independent AAA patient cohorts is highly predictive of a AAA diagnosis and associates more strongly with aneurysm growth rate when compared to D-dimer in humans. Finally, intervention with the anti-GPVI antibody (JAQ1) in mice with established aneurysms blunted the progression of AAA in two independent mouse models. In conclusion, we show that levels of sGPVI in humans can predict a diagnosis of AAA and AAA growth rate, which may be critical in the identification of high-risk patients. We also identify GPVI as a novel platelet-specific AAA therapeutic target, with minimal risk of adverse bleeding complications, where none currently exist.