Mikka Vikkula and colleagues report somatic mutations in the gene encoding the receptor tyrosine kinase TIE2 in inherited and common sporadic venous malformations. These mutations alter localization of the receptor and its response to ligand. Germline substitutions in the endothelial cell tyrosine kinase receptor TIE2 (encoded by TEK) cause a rare, inherited form of venous anomaly known as a mucocutaneous venous malformation (VMCM; refs. 1, 2, 3 and V.W., N.L., M.U., A. Irrthum, L.M.B. et al., unpublished data). We identified a somatic 'second hit' causing loss of function of TIE2 in a resected VMCM and assessed whether such localized, tissue-specific events have a role in the etiology of sporadic venous malformations, which are far more common. We identified eight somatic TEK mutations in lesions from 28 of 57 individuals (49.1%) with sporadic venous malformations; the mutations were absent from the individuals' blood and control tissues. The somatic mutations included one causing a frequent L914F substitution and several double mutations in cis, all of which resulted in ligand-independent TIE2 hyperphosphorylation in vitro. When overexpressed in human umbilical vein endothelial cells, the L914F mutant was abnormally localized and responded to ligand, in contrast to wild-type TIE2 and the common, inherited R849W mutant, suggesting that the mutations have distinct effects. The presence of the same mutations in multifocal sporadic venous malformations in two individuals suggests a common origin for the abnormal endothelial cells at the distant sites. These data show that a sporadic disease may be explained by somatic changes in a gene causing rare, inherited forms and pinpoint TIE2 pathways as potential therapeutic targets for venous malformations.

Angiopoietins regulate vascular homeostasis via the endothelial Tie receptor tyrosine kinases. Angiopoietin-1 (Ang1) supports endothelial stabilization via Tie2 activation. Angiopoietin-2 (Ang2) functions as a context-dependent Tie2 agonist/antagonist promoting pathological angiogenesis, vascular permeability and inflammation. Elucidating Ang2-dependent mechanisms of vascular destablization is critical for rational design of angiopoietin antagonists that have demonstrated therapeutic efficacy in cancer trials. Here, we report that Ang2, but not Ang1, activates β1-integrin, leading to endothelial destablization. Autocrine Ang2 signalling upon Tie2 silencing, or in Ang2 transgenic mice, promotes β1-integrin-positive elongated matrix adhesions and actin stress fibres, regulating vascular endothelial-cadherin-containing cell-cell junctions. The Tie2-silenced monolayer integrity is rescued by β1-integrin, phosphoinositide-3 kinase or Rho kinase inhibition, and by re-expression of a membrane-bound Tie2 ectodomain. Furthermore, Tie2 silencing increases, whereas Ang2 blocking inhibits transendothelial tumour cell migration in vitro. These results establish Ang2-mediated β1-integrin activation as a promoter of endothelial destablization, explaining the controversial vascular functions of Ang1 and Ang2.

Venous malformations (VMs) are composed of ectatic veins with scarce smooth muscle cell coverage. Activating mutations in the endothelial cell tyrosine kinase receptor TIE2 are a common cause of these lesions. VMs cause deformity, pain, and local intravascular coagulopathy, and they expand with time. Targeted pharmacological therapies are not available for this condition. Here, we generated a model of VMs by injecting HUVECs expressing the most frequent VM-causing TIE2 mutation, TIE2-L914F, into immune-deficient mice. TIE2-L914F-expressing HUVECs formed VMs with ectatic blood-filled channels that enlarged over time. We tested both rapamycin and a TIE2 tyrosine kinase inhibitor (TIE2-TKI) for their effects on murine VM expansion and for their ability to inhibit mutant TIE2 signaling. Rapamycin prevented VM growth, while TIE2-TKI had no effect. In cultured TIE2-L914F-expressing HUVECs, rapamycin effectively reduced mutant TIE2-induced AKT signaling and, though TIE2-TKI did target the WT receptor, it only weakly suppressed mutant-induced AKT signaling. In a prospective clinical pilot study, we analyzed the effects of rapamycin in 6 patients with difficult-to-treat venous anomalies. Rapamycin reduced pain, bleeding, lesion size, functional and esthetic impairment, and intravascular coagulopathy. This study provides a VM model that allows evaluation of potential therapeutic strategies and demonstrates that rapamycin provides clinical improvement in patients with venous malformation.

Abstract Background Inside the incompressible cranium, the volume of cerebrospinal fluid (CSF) is directly linked to blood volume: a change in either will induce a compensatory change in the other. Vasodilatory lowering of blood pressure has been shown to result in an increase of intracranial pressure, which, in normal circumstances should return to equilibrium by increased fluid efflux. In this study, we investigated the effect of blood pressure lowering (BPL) on fluorescent CSF tracer absorption into the systemic blood circulation. Methods BPL was performed by an i.v. administration of nitric oxide donor sodium nitroprusside (5 µg kg -1 min -1 ) or the Ca 2+ -channel blocker nicardipine hydrochloride (0.5 µg kg -1 min -1 ) for 10 and 15 to 40 mins, respectively. The effect of BPL on CSF clearance was investigated by measuring the efflux of fluorescent tracers (40 kDa FITC-dextran, 45 kDa Texas Red-conjugated ovalbumin) into blood and deep cervical lymph nodes. Results Nicardipine and sodium nitroprusside reduced blood pressure by 32.0 ± 19.6% and 22.0 ± 2.5%, while temporarily elevating in intracranial pressure by 14.0 ± 6.0% and 11.6 ± 2.0%, respectively. BPL significantly increased tracer accumulation into deep cervical lymph nodes and systemic circulation, but reduced perivascular inflow along penetrating arteries in the brain. The enhanced tracer efflux by BPL into the systemic circulation was markedly reduced (-66.7%) by ligation of lymphatic vessels draining into deep cervical lymph nodes. Conclusions This is the first study showing that CSF clearance can be improved with acute hypotensive treatment and that the effect of the treatment is reduced by ligation of a lymphatic drainage pathway. Enhanced CSF clearance by BPL may have therapeutic potential in diseases with dysregulated CSF flow.

Abstract The pathogenesis of numerous diseases is characterised by disruption of the junctions that form the endothelial cell (EC) barrier, the composition of which may differ greatly between organs. However, the expression level variability and precise contribution of different junctional proteins is poorly understood. Here, we focus on organs with continuous endothelium to identify structural and functional in vivo characteristics of the EC barrier. Assembly of multiple single-cell RNAseq datasets into a single integrated database revealed the variability in EC barrier patterning. Across tissues Claudin5 exhibited diminishing expression along the arteriovenous axis, which correlates with EC barrier integrity. Functional analysis identified tissue-specific differences in leakage patterning and response to agonist-induced leakage. We uncover that Claudin5 loss enhances agonist-induced leakage in an organotypic, vessel type-specific and size-selective manner in an inducible, EC-specific, knock-out mouse. Mechanistically, Claudin5 loss induces no change in junction ultrastructure but alters composition, with concomitant loss of zonula occludens-1 (ZO-1) expression and upregulation of VE-Cadherin. These findings uncover the organ-specific organisation of the EC barrier and distinct importance of Claudin5 in different vascular beds and will aid our ability to modify EC barrier stability in a targeted, organ-specific manner.

Primary lymphedema (PL), characterized by tissue swelling, fat accumulation and fibrosis, results from defective lymphatic vessels or valves caused by mutations in genes involved in development, maturation and function of the lymphatic vascular system. Pathogenic variants in various genes have been identified in about 30% of PL cases. By screening of a cohort of 755 individuals with PL, we identified two TIE1 (tyrosine kinase with immunoglobulin- and epidermal growth factor-like domains 1) missense variants and one truncating variant, all predicted to be pathogenic by bioinformatic algorithms. The TIE1 receptor, in complex with TIE2, binds angiopoietins to regulate the formation and remodelling of blood and lymphatic vessels. The premature stop codon mutant encoded an inactive truncated extracellular TIE1 fragment with decreased mRNA stability and the amino acid substitutions led to decreased TIE1 signaling activity. By reproducing the two missense variants in mouse Tie1 via CRISPR-Cas9, we showed that both cause edema and are lethal in homozygous mice. Thus, our results indicate that TIE1 loss-of-function variants can cause lymphatic dysfunction in patients. Together with our earlier demonstration that ANGPT2 loss-of-function mutations can also cause PL, our results emphasize the important role of the ANGPT2-TIE1 pathway in lymphatic function.