Abstract Recent advances in cancer genomics have highlighted aberrant expression of various families of non-coding RNAs in all cancer types, including lung adenocarcinomas (LUAD). Here we aim to better understand the functions of long non coding RNAs (lncRNAs) regulated by the hypoxic response in LUAD cells, conditions that promote tumor aggressiveness and drug resistance. We performed a single-cell CRISPR-interference-based (CRISPRi) transcriptome screening (CROP-Seq) for HIF1A, HIF2, and a subset of lncRNA candidates regulated by hypoxia and/or potentially associated with LUAD prognosis. The mini-CROP-seq library of validated guides RNA (gRNA) was amplified and transduced in A549 LUAD cells cultured in normoxia or exposed to hypoxic conditions during 3, 6 or 24 hours. To overcome the challenge of detecting subtle gRNA-induced transcriptomic perturbation and classifying the most responsive cells, we used a new supervised autoencoding neural networks method (SAE), leveraging on both transcriptomic data and cell labels corresponding to known received gRNA. We first validated the SAE approach on HIF1A and HIF2 by confirming the specific effect of their knock-down during the temporal switch of the hypoxic response. Next, the SAE method was able to detect stable short hypoxia-dependent transcriptomic signatures induced by the knock-down of some lncRNA candidates, outperforming previously published machine learning approaches. This proof of concept demonstrates the relevance of the SAE approach for deciphering weak perturbations in single-cell transcriptomic data readout as part of CRISPR-based screening.

ABSTRACT Introduction and main objectives Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic, progressive and irreversible interstitial lung disease (ILD), that increases dramatically in incidence and prevalence with age. While successful alveolar regeneration after injury depends on pulmonary capillary endothelial cells (PCEC) reprogramming, the steps involving PCEC during lung injury and resolution as well as the influence of aging are unknown. Methods We used single-cell RNA-seq (scRNA-seq) and spatial transcriptomics to compare the transcriptome of bleomycin-induced fibrotic lungs of young (7 weeks) and aged (18 months) mice, at 3 time points corresponding to the peak of fibrosis (14 days), regeneration (28 days) and resolution (60 days). Results Among the 44541 sequenced and annotated cells, we confirmed the transcriptomic dynamics of several cell types including macrophages, in which conversion is conserved between young and aged mice. We also found that lung injury shifts the transcriptomic profiles of recently described PCEC cell types, with 4 prominent signatures. These signatures are characterized by the overexpression of Lrg1 and are associated with pro-angiogenic signaling, potentially supported by adjacent cell types into the alveolar niche. These signatures were not equally maintained through the resolution process and between young and old animals. Moreover, part of this set of resolution-associated markers was also detected in pulmonary endothelial cells (ECs) from IPF samples. Finally, we found that aging also altered the transcriptome of general capillary cells (gCap) which display typical pro-fibrotic and pro-inflammatory features. Conclusions We provide a detailed characterization of the cellular dynamics associated with fibrosis development and resolution in young and aged lungs and propose that age-associated alterations in specific PCEC subpopulations may interfere with the process of lung progenitor differentiation contributing to the persistent fibrotic process typical of human pathology.

Abstract Mammary carcinoma, including triple-negative breast carcinomas (TNBC) are tumor-types for which human and canine pathologies are closely related at the molecular level. Low-passage, primary carcinoma cells from TNBC versus non-TNBC were used to compare the efficacy of an oncolytic vaccinia virus (VV). We show that non-TNBC cells are 28 times more sensitive to VV than TNBC cells in which VV replication is impaired. Single-cell RNA-seq performed on two different TNBC cell samples infected or not with VV highlighted three distinct populations: naïve cells, bystander cells, defined as cells exposed to the virus but not infected and infected cells. The transcriptome of these three populations showed striking variations in the modulation of pathways regulated by cytokines and growth factors. We hypothesized that the pool of genes expressed in the bystander populations was enriched in antiviral genes. Bio-informatic analysis suggested that the reduced activity of the virus was associated with a higher mesenchymal status of the cells. In addition, we demonstrate experimentally that high expression of one gene, DDIT4, is detrimental to VV production. Considering that DDIT4 is associated with a poor prognosis in various cancers including TNBC, out data highlight DDIT4 as a candidate resistance marker for oncolytic poxvirus therapy. This information could be used to design new generations of oncolytic poxviruses. Beyond the field of gene therapy, this study demonstrate that single-cell transcriptomics can be used to identify cellular factors influencing viral replication. Author summary The identification of cellular genes influencing viral replication/propagation have been studied using hypothesis-driven approaches and/or high-throughput RNA interference screens. In the present report, we propose a methodology based on single-cell transcriptomic. We have studied, in the context of oncolytic virothepary, the susc eptibility of primary, low-passage mammary carcinoma cells of canine origin from different grades to an oncolytic vaccinia virus (VV). We highlight a fault in replication of VV in cells originated from high-grade triple-negative breast carcinomas (TNBC). Single-cell RNA-seq performed on TNBC cell samples infected with VV suggested that the reduced activity of the virus was associated with a higher mesenchymal status of the cells. We also demonstrate that high expression of one gene, DDIT4, is detrimental to VV production. Considering that DDIT4 is associated with a poor prognosis in various cancers including TNBC, out data highlight DDIT4 as a candidate resistance marker for oncolytic poxvirus therapy. Beyond the field of cancer gene therapy, we demonstrate here that single-cell transcriptomics increases the arsenal of tools available to identify cellular factors influencing viral replication.