The skin barrier is the body’s first line of defence against environmental assaults, and is maintained by epithelial stem cells (EpSCs). Despite the vulnerability of EpSCs to inflammatory pressures, neither the primary response to inflammation nor its enduring consequences are well understood. Here we report a prolonged memory to acute inflammation that enables mouse EpSCs to hasten barrier restoration after subsequent tissue damage. This functional adaptation does not require skin-resident macrophages or T cells. Instead, EpSCs maintain chromosomal accessibility at key stress response genes that are activated by the primary stimulus. Upon a secondary challenge, genes governed by these domains are transcribed rapidly. Fuelling this memory is Aim2, which encodes an activator of the inflammasome. The absence of AIM2 or its downstream effectors, caspase-1 and interleukin-1β, erases the ability of EpSCs to recollect inflammation. Although EpSCs benefit from inflammatory tuning by heightening their responsiveness to subsequent stressors, this enhanced sensitivity probably increases their susceptibility to autoimmune and hyperproliferative disorders, including cancer. After acute inflammation, epithelial stem cells retain a memory that accelerates restoration of the skin barrier during subsequent tissue damage, and this enhancement is dependent on the AIM2 inflammasome and its downstream effectors. In the skin, epithelial stem cells form a barrier against environmental damage. Shruti Naik et al. now show that after acute inflammation, epithelial stem cells retain a memory that hastens barrier restoration during subsequent tissue damage. However, the increased sensitivity to further insults may also increase tissue damage and susceptibility to other disorders such as autoimmune diseases and cancer.

Mining modern genomics for cancer therapies is predicated on weeding out "bystander" alterations (nonconsequential mutations) and identifying "driver" mutations responsible for tumorigenesis and/or metastasis. We used a direct in vivo RNA interference (RNAi) strategy to screen for genes that upon repression predispose mice to squamous cell carcinomas (SCCs). Seven of our top hits-including Myh9, which encodes nonmuscle myosin IIa-have not been linked to tumor development, yet tissue-specific Myh9 RNAi and Myh9 knockout trigger invasive SCC formation on tumor-susceptible backgrounds. In human and mouse keratinocytes, myosin IIa's function is manifested not only in conventional actin-related processes but also in regulating posttranscriptional p53 stabilization. Myosin IIa is diminished in human SCCs with poor survival, which suggests that in vivo RNAi technology might be useful for identifying potent but low-penetrance tumor suppressors.

Abstract Transcriptional and translational control are key determinants of gene expression, however, to what extent these two processes can be collectively coordinated is still poorly understood. Here we use long-read sequencing to document the 5’and 3’untranslated region (UTR) isoform landscape of epidermal stem cells, wild-type keratinocytes and squamous cell carcinomas. Focusing on squamous cell carcinomas, we show that a small cohort of genes with alternative 5’UTR isoforms exhibit overall increased translational efficiencies and are enriched in ribosomal proteins and splicing factors. These 5’UTR isoforms with identical coding sequences either include or exclude 5’terminal oligopyrimidine (TOP) motifs and result in vastly altered translational efficiencies of the mRNA. Our findings suggest that switching between TOP and non-TOP motif-containing 5’UTR isoforms is an elegant and simple way to alter protein synthesis rates, set their sensitivity to the mTORC1-dependent nutrient-sensing pathway and direct the translational potential of an mRNA by the precise 5’UTR sequence.

Abstract Functionally characterizing the genetic alterations that drive pancreatic cancer progression is a prerequisite for Precision Medicine. Here, we developed a somatic CRISPR/Cas9 mutagenesis screen to assess the transforming potential of 125 recurrently mutated ‘long-tail’ pancreatic cancer genes, which revealed USP15 and SCAF1 as novel and potent Pancreatic ductal adenocarcinoma PDAC tumor suppressors, with USP15 functioning in a haplo-insufficient manner. Mechanistically, we found that loss of USP15 leads to reduced inflammatory responses associated with TNFα, TGF-β and IL6 signaling and sensitizes pancreatic cancer cells to PARP inhibition and gemcitabine. Similarly, genetic ablation of SCAF1 reduced inflammatory responses linked to TNFα, TGF-β and mTOR signaling and increased sensitivity to PARP inhibition. Furthermore, we identified that loss of SCAF1 resulted in the formation of a truncated inactive USP15 isoform at the expense of full length USP15, functionally coupling SACF1 and USP15. Notably, USP15 and SCAF1 mutations or copy number losses are observed in 31% of PDAC patients. Together, our results demonstrate the utility of in vivo CRISPR to integrate human cancer genomics with mouse modeling to delineate novel cancer driver genes USP15 and SCAF1 such as with potential prognostic and therapeutic implications.

Functionally characterizing the genetic alterations that drive pancreatic cancer is a prerequisite for precision medicine. Here, we perform somatic CRISPR/Cas9 mutagenesis screens to assess the transforming potential of 125 recurrently mutated pancreatic cancer genes, which revealed USP15 and SCAF1 as pancreatic tumor suppressors. Mechanistically, we find that USP15 functions in a haploinsufficient manner and that loss of USP15 or SCAF1 leads to reduced inflammatory TNFα, TGF-β and IL6 responses and increased sensitivity to PARP inhibition and Gemcitabine. Furthermore, we find that loss of SCAF1 leads to the formation of a truncated, inactive USP15 isoform at the expense of full-length USP15, functionally coupling SCAF1 and USP15. Notably, USP15 and SCAF1 alterations are observed in 31% of pancreatic cancer patients. Our results highlight the utility of in vivo CRISPR screens to integrate human cancer genomics and mouse modeling for the discovery of cancer driver genes with potential prognostic and therapeutic implications.

Abstract When cells encounter stressful situations, they activate the integrated stress response (ISR), which limits total protein synthesis and redirects translation to proteins that help the cells to cope. The ISR has also been implicated in cancers, but redundancies in the stress-sensing kinases that trigger the ISR have posed hurdles to dissecting physiological relevance. To overcome this challenge, we targeted the regulatory node of these kinases, namely the S51 phosphorylation site of eukaryotic translation initiation factor eIF2α and genetically replaced eIF2α with eIF2α-S51A in squamous cell carcinoma (SCC) stem cells. While inconsequential under normal growth conditions, the vulnerability of this ISR-null state was unveiled when SCC stem cells experienced proteotoxic stress. Seeking mechanistic insights into the protective roles of the ISR, we combined ribosome profiling and functional approaches to identify and probe the functional importance of translational differences between ISR-competent and ISR-null SCC stem cells when exposed to proteotoxic stress. In doing so, we learned that the ISR redirects translation to centrosomal proteins that orchestrate the microtubule dynamics needed to efficiently concentrate unfolded proteins at the microtubule organizing center so that they can be cleared by the perinuclear degradation machinery. Thus, rather than merely maintaining survival during stress, the ISR also functions in promoting cellular recovery once the stress has subsided. This finding exposes a vulnerability to SCC stem cells that could be exploited therapeutically.

The tumor evolution model posits that malignant transformation is preceded by randomly distributed driver mutations in cancer genes, which cause clonal expansions in phenotypically normal tissues. Although clonal expansions occur frequently in human epithelia and can remodel almost entire tissues, the mechanisms behind why only a small number of clones transform into malignant tumors remain enigmatic. Here, we develop an in vivo single-cell CRISPR strategy to systematically investigate tissue-wide clonal dynamics of the 150 most frequently mutated squamous cell carcinoma genes. We couple ultrasound-guided in utero lentiviral microinjections, single-cell RNA sequencing, guide capture and spatial transcriptomics to longitudinally monitor cell type-specific clonal expansions, document their underlying gene programs and contrast clonal expansions from tumor initiation. We uncover a TNF-α signaling module that acts as a generalizable driver of clonal expansions in epithelial tissues. Conversely, during tumorigenesis, the TNF-α signaling module is downregulated, and instead, we identify a subpopulation of invasive cancer cells that switch to an autocrine TNF-α gene program. By analyzing clonally expanded perturbations and their frequency in tumors, we demonstrate that the autocrine TNF-α gene program is associated with epithelial-mesenchymal transition (EMT) and is preexistent in a subpopulation of expanded epidermal stem cells, contributing to the predisposition for tumor initiation. Finally, we provide in vivo evidence that the epithelial TNF-α gene program is sufficient to mediate invasive properties of epidermal stem cells and show that the TNF-α signature correlates with shorter overall survival in human squamous cell carcinoma patients. Collectively, our study demonstrates the power of applying in vivo single-cell CRISPR screening to mammalian tissues and unveils distinct TNF-α programs in tumor evolution. Understanding the biology of clonal expansions in phenotypically normal epithelia and the mechanisms governing their transformation will guide the development of novel strategies for early cancer detection and therapy.