We have found a novel activity in Tetrahymena cell free extracts that adds tandem TTGGGG repeats onto synthetic telomere primers. The single-stranded DNA oligonucleotides (TTGGGG)4 and TGTGTGGGTGTGTGGGTGTGTGGG, consisting of the Tetrahymena and yeast telomeric sequences respectively, each functioned as primers for elongation, while (CCCCAA)4 and two nontelomeric sequence DNA oligomers did not. Efficient synthesis of the TTGGGG repeats depended only on addition of micromolar concentrations of oligomer primer, dGTP, and dTTP to the extract. The activity was sensitive to heat and proteinase K treatment. The repeat addition was independent of both endogenous Tetrahymena DNA and the endogenous alpha-type DNA polymerase; and a greater elongation activity was present during macronuclear development, when a large number of telomeres are formed and replicated, than during vegetative cell growth. We propose that the novel telomere terminal transferase is involved in the addition of telomeric repeats necessary for the replication of chromosome ends in eukaryotes.

Eukaryotic chromosomes are capped with repetitive telomere sequences that protect the ends from damage and rearrangements. Telomere repeats are synthesized by telomerase, a ribonucleic acid (RNA)-protein complex. Here, the cloning of the RNA component of human telomerase, termed hTR, is described. The template region of hTR encompasses 11 nucleotides (5′-CUAACCCUAAC) complementary to the human telomere sequence (TTAGGG) n . Germline tissues and tumor cell lines expressed more hTR than normal somatic cells and tissues, which have no detectable telomerase activity. Human cell lines that expressed hTR mutated in the template region generated the predicted mutant telomerase activity. HeLa cells transfected with an antisense hTR lost telomeric DNA and began to die after 23 to 26 doublings. Thus, human telomerase is a critical enzyme for the long-term proliferation of immortal tumor cells.

When human fibroblasts from different donors are grown in vitro, only a small fraction of the variation in their finite replicative capacity is explained by the chronological age of the donor. Because we had previously shown that telomeres, the terminal guanine-rich sequences of chromosomes, shorten throughout the life-span of cultured cells, we wished to determine whether variation in initial telomere length would account for the unexplained variation in replicative capacity. Analysis of cells from 31 donors (aged 0-93 yr) indicated relatively weak correlations between proliferative ability and donor age (m = -0.2 doubling per yr; r = -0.42; P = 0.02) and between telomeric DNA and donor age (m = -15 base pairs per yr; r = -0.43; P = 0.02). However, there was a striking correlation, valid over the entire age range of the donors, between replicative capacity and initial telomere length (m = 10 doublings per kilobase pair; r = 0.76; P = 0.004), indicating that cell strains with shorter telomeres underwent significantly fewer doublings than those with longer telomeres. These observations suggest that telomere length is a biomarker of somatic cell aging in humans and are consistent with a causal role for telomere loss in this process. We also found that fibroblasts from Hutchinson-Gilford progeria donors had short telomeres, consistent with their reduced division potential in vitro. In contrast, telomeres from sperm DNA did not decrease with age of the donor, suggesting that a mechanism for maintaining telomere length, such as telomerase expression, may be active in germ-line tissue.

Research Article1 May 1992free access Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. C.M. Counter C.M. Counter Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author A.A. Avilion A.A. Avilion Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author C.E. LeFeuvre C.E. LeFeuvre Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author N.G. Stewart N.G. Stewart Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author C.W. Greider C.W. Greider Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author C.B. Harley C.B. Harley Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author S. Bacchetti S. Bacchetti Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author C.M. Counter C.M. Counter Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author A.A. Avilion A.A. Avilion Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author C.E. LeFeuvre C.E. LeFeuvre Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author N.G. Stewart N.G. Stewart Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author C.W. Greider C.W. Greider Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author C.B. Harley C.B. Harley Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author S. Bacchetti S. Bacchetti Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. Search for more papers by this author Author Information C.M. Counter1, A.A. Avilion1, C.E. LeFeuvre1, N.G. Stewart1, C.W. Greider1, C.B. Harley1 and S. Bacchetti1 1Department of Pathology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada. The EMBO Journal (1992)11:1921-1929https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1992.tb05245.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Loss of telomeric DNA during cell proliferation may play a role in ageing and cancer. Since telomeres permit complete replication of eukaryotic chromosomes and protect their ends from recombination, we have measured telomere length, telomerase activity and chromosome rearrangements in human cells before and after transformation with SV40 or Ad5. In all mortal populations, telomeres shortened by approximately 65 bp/generation during the lifespan of the cultures. When transformed cells reached crisis, the length of the telomeric TTAGGG repeats was only approximately 1.5 kbp and many dicentric chromosomes were observed. In immortal cells, telomere length and frequency of dicentric chromosomes stabilized after crisis. Telomerase activity was not detectable in control or extended lifespan populations but was present in immortal populations. These results suggest that chromosomes with short (TTAGGG)n tracts are recombinogenic, critically shortened telomeres may be incompatible with cell proliferation and stabilization of telomere length by telomerase may be required for immortalization. Previous ArticleNext Article Volume 11Issue 51 May 1992In this issue RelatedDetailsLoading ...

To examine the role of telomerase in normal and neoplastic growth, the telomerase RNA component (mTR) was deleted from the mouse germline. mTR−/− mice lacked detectable telomerase activity yet were viable for the six generations analyzed. Telomerase-deficient cells could be immortalized in culture, transformed by viral oncogenes, and generated tumors in nude mice following transformation. Telomeres were shown to shorten at a rate of 4.8 ± 2.4 kb per mTR−/− generation. Cells from the fourth mTR−/− generation onward possessed chromosome ends lacking detectable telomere repeats, aneuploidy, and chromosomal abnormalities, including end-to-end fusions. These results indicate that telomerase is essential for telomere length maintenance but is not required for establishment of cell lines, oncogenic transformation, or tumor formation in mice.

Abstract

 Telomere maintenance is thought to play a role in signaling cellular senescence; however, a link with organismal aging processes has not been established. The telomerase null mouse provides an opportunity to understand the effects associated with critical telomere shortening at the organismal level. We studied a variety of physiological processes in an aging cohort of mTR^−/− mice. Loss of telomere function did not elicit a full spectrum of classical pathophysiological symptoms of aging. However, age-dependent telomere shortening and accompanying genetic instability were associated with shortened life span as well as a reduced capacity to respond to stresses such as wound healing and hematopoietic ablation. In addition, we found an increased incidence of spontaneous malignancies. These findings demonstrate a critical role for telomere length in the overall fitness, reserve, and well being of the aging organism.

Idiopathic pulmonary fibrosis is progressive and often fatal; causes of familial clustering of the disease are unknown. Germ-line mutations in the genes hTERT and hTR, encoding telomerase reverse transcriptase and telomerase RNA, respectively, cause autosomal dominant dyskeratosis congenita, a rare hereditary disorder associated with premature death from aplastic anemia and pulmonary fibrosis.

Abstract

 We have analyzed the de novo telomere synthesis catalyzed by the enzyme telomere terminal transferase (telomerase) from Tetrahymena. Oligonucleotides representing the G-rich strand of telomeric sequences from five different organisms specifically primed the addition of TTGGGG repeats in vitro, suggesting that primer recognition may involve a DNA structure unique to these oligonucleotides. The sequence at the 3′ end of the oligonucleotide primer specified the first nucleotide added in the reaction. Furthermore, the telomerase was shown to be a ribonucleoprotein complex whose RNA and protein components were both essential for activity. After extensive purification of the enzyme by a series of five different chromatographic steps, a few small low abundance RNAs copurified with the activity.