Complementary DNAs for three different muscarinic acetylcholine receptors were isolated from a rat cerebral cortex library, and the cloned receptors were expressed in mammalian cells. Analysis of human and rat genomic clones indicates that there are at least four functional muscarinic receptor genes and that these genes lack introns in the coding sequence. This gene family provides a new basis for evaluating the diversity of muscarinic mechanisms in the nervous system.

The human and rat genes for a fifth muscarinic receptor have been cloned and expressed in mammalian cells. The 532 amino acid human protein has 89% sequence identity to the 531 amino acid rat protein and is most closely related to the m3 receptor. Both proteins are encoded by single exons. The receptor has intermediate affinity for pirenzepine and low affinity for AF-DX 116, and it increases metabolism of phosphatidylinositol when stimulated with carbachol. Expression of mRNA has yet to be observed in brain or selected peripheral tissues, suggesting that either it is substantially less abundant than m1-m4 or its distribution is quite different.

A family of five cholinergic muscarinic receptor genes (m1, m2, m3, m4, and m5) has recently been identified and cloned. In order to investigate the pharmacological properties of the individual muscarinic receptors, we have transfected each of these genes into Chinese hamster ovary cells (CHO-K1) and have established stable cell lines expressing each receptor. In the present study we have examined the antagonist binding properties of each muscarinic receptor. Antagonists were chosen that had previously been proposed to be selective for muscarinic receptor subtypes and included pirenzepine, AF-DX 116, methoctramine, dicyclomine, hexohydrodifenidol, hexahydrosiladifenidol, hexocyclium, and silahexocyclium. m1, m2, and m3 receptors express binding properties similar to those expected of high affinity pirenzepine-type receptors of cerebral cortex ("M1"), low affinity pirenzepine-type receptors of atria ("M2 cardiac type"), and the intermediate affinity pirenzepine-type receptors found in exocrine glands ("M2 glandular type"), respectively. The M1/M2 schema cannot readily accommodate the binding properties of the m4 and m5 receptors. Pirenzepine, methoctramine, and hexahydrosiladifenidol were the most selective agents for the m1, m2, and m3 receptors, respectively. None of the antagonists used in this study were uniquely selective for either the m4 or m5 receptors. The diverse binding profiles of individual cloned receptors and the widespread distribution of m1-m4 mRNAs indicate that radioligand binding studies performed on primary tissues may actually be assessing the composite properties of a heterogeneous mixture of muscarinic receptor subtypes.

A family of 4 rat muscarinic receptors (m1, m2, m3, and m4) have recently been cloned and sequenced (Bonner et al., 1987). Since pharmacological probes that are presently available do not appear to distinguish among 3 of these muscarinic receptors, we constructed oligonucleotide probes corresponding to the N-terminal sequences of the muscarinic receptors and used them to specifically localize m1, m2, m3, and m4 mRNA in sections of rat brain using in situ hybridization histochemistry. Northern analysis demonstrated a 3.1 kilobase (kb) m 1 mRNA, a 4.5 kb m3 mRNA, and a 3.3 kb m4 mRNA in cerebral cortex, striatum, hippocampus, and cerebellum. In situ hybridization histochemistry indicated a prevalence of m1 mRNA in the pyramidal cell layer of the hippocampus, the granule cell layer of the dentate gyrus, the olfactory bulb, amygdala, olfactory tubercule, and piriform cortex. Caudate putamen and cerebral cortex showed moderate levels of labeling. m2 mRNA was detectable in the medial septum, diagonal band, olfactory bulb, and pontine nuclei. m3 and m4 mRNA were also prevalent in the olfactory bulb and pyramidal cell layer of the hippocampus but were present only in low levels in the dentate gyrus. m3 mRNA was present in superficial and deep layers of the cerebral cortex, whereas m4 mRNA was more evenly distributed with a slightly more intense labeling evident in the midcortical layer. In addition, m3 mRNA was present in a number of thalamic nuclei and brain-stem nuclei, while m4 mRNA predominated in the caudate putamen. These data offer a new basis on which to interpret the heterogeneity of muscarinic actions in the CNS.

The completion of whole genome sequencing projects has provided the genetic instructions of life. However, whereas the identification of gene coding regions has progressed, the mapping of transcriptional regulatory motifs has moved more slowly. To understand how distinct expression profiles can be established and maintained, a greater understanding of these sequences and their trans-acting factors is required. Herein we have used a combined in silico and biochemical approach to identify binding sites [repressor element 1/neuron-restrictive silencer element (RE1/NRSE)] and potential target genes of RE1 silencing transcription factor/neuron-restrictive silencing factor (REST/NRSF) within the human, mouse, and Fugu rubripes genomes. We have used this genome-wide analysis to identify 1,892 human, 1,894 mouse, and 554 Fugu RE1/NRSEs and present their location and gene linkages in a searchable database. Furthermore, we identified an in vivo hierarchy in which distinct subsets of RE1/NRSEs interact with endogenous levels of REST/NRSF, whereas others function as bona fide transcriptional control elements only in the presence of elevated levels of REST/NRSF. These data show that individual RE1/NRSE sites interact differentially with REST/NRSF within a particular cell type. This combined bioinformatic and biochemical approach serves to illustrate the selective manner in which a transcription factor interacts with its potential binding sites and regulates target genes. In addition, this approach provides a unique whole-genome map for a given transcription factor-binding site implicated in establishing specific patterns of neuronal gene expression.

Proneural genes such as Ascl1 are known to promote cell cycle exit and neuronal differentiation when expressed in neural progenitor cells. The mechanisms by which proneural genes activate neurogenesis--and, in particular, the genes that they regulate--however, are mostly unknown. We performed a genome-wide characterization of the transcriptional targets of Ascl1 in the embryonic brain and in neural stem cell cultures by location analysis and expression profiling of embryos overexpressing or mutant for Ascl1. The wide range of molecular and cellular functions represented among these targets suggests that Ascl1 directly controls the specification of neural progenitors as well as the later steps of neuronal differentiation and neurite outgrowth. Surprisingly, Ascl1 also regulates the expression of a large number of genes involved in cell cycle progression, including canonical cell cycle regulators and oncogenic transcription factors. Mutational analysis in the embryonic brain and manipulation of Ascl1 activity in neural stem cell cultures revealed that Ascl1 is indeed required for normal proliferation of neural progenitors. This study identified a novel and unexpected activity of the proneural gene Ascl1, and revealed a direct molecular link between the phase of expansion of neural progenitors and the subsequent phases of cell cycle exit and neuronal differentiation.

Huntington's disease (HD) is a dominantly-inherited neurodegenerative disorder which is incurable and ultimately fatal. HD is characterised by widespread mRNA dysregulation, particularly in neurons of the forebrain, by mechanisms which are not fully understood. Such dysregulation has been demonstrated to result, in part, from aberrant nuclear localisation of the transcriptional repressor, REST. Here, we show that expression of a number of neuronal-specific microRNAs is also dysregulated in HD tissues, probably as a result of increased repression by REST. This phenomenon is observed in both murine models of HD and in the brains of human HD sufferers. MicroRNA loss is reflected in increased levels of a number of target messenger RNAs. These data are the first to demonstrate a role for microRNAs in HD, and indicate that the molecular aetiology of HD is reflected in a loss of neuronal identity, caused in part by dysregulation of both transcriptional and post-transcriptional mechanisms.

Abstract Establishing preclinical models of Alzheimer’s disease that predict clinical outcomes remains a critically important, yet to date not fully realised, goal. Models derived from human cells offer considerable advantages over non-human models, including the potential to reflect some of the inter-individual differences that are apparent in patients. Here we report an approach using induced pluripotent stem cell-derived cortical neurons from people with early symptomatic Alzheimer’s disease where we sought a match between individual disease characteristics in cells with analogous characteristics in the people from whom they were derived. We show that the response to amyloid-β burden in life, as measured by cognitive decline and brain activity levels, varies between individuals and this vulnerability rating correlates with the individual cellular vulnerability to extrinsic amyloid-β in vitro as measured by synapse loss and function. Our findings indicate that patient induced pluripotent stem cell-derived cortical neurons not only present key aspects of Alzheimer’s disease pathology, but also reflect key aspects of the clinical phenotypes of the same patients. Cellular models that reflect an individual’s in-life clinical vulnerability thus represent a tractable method of Alzheimer’s disease modelling using clinical data in combination with cellular phenotypes.

Endocannabinoids regulate different aspects of neurodevelopment. In utero exposure to the exogenous psychoactive cannabinoid Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), has been linked with abnormal cortical development in animal models. However, much less is known about the actions of endocannabinoids in human neurons. Here we investigated the effect of the endogenous endocannabinoid 2-arachidonoyl glycerol (2AG) and Δ9-THC on the development of neuronal morphology and activation of signaling kinases, in cortical glutamatergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Our data indicate that the cannabinoid type 1 receptor (CB1R), but not the cannabinoid 2 receptor (CB2R), GPR55 or TRPV1 receptors, is expressed in young, immature hiPSC-derived cortical neurons. Consistent with previous reports, 2AG and Δ9-THC negatively regulated neurite outgrowth. Interestingly, acute exposure to both 2AG and Δ9-THC inhibited phosphorylation of serine/threonine kinase extracellular signal-regulated protein kinases (ERK1/2), whereas Δ9-THC also reduced phosphorylation of Akt (aka PKB). Moreover, the CB1R inverse agonist SR141716A attenuated the negative regulation of neurite outgrowth and ERK1/2 phosphorylation induced by 2AG and Δ9-THC. Taken together, our data suggest that hiPSC-derived cortical neurons highly express CB1Rs and are responsive to both endogenous and exogenous cannabinoids. Thus, hiPSC-neurons may represent a good cellular model for investigating the role of the endocannabinoid system in regulating cellular processes in human neurons.

Abstract Treatment of neurons with β-amyloid peptide (Aβ 1-42 ) has been widely used as a model to interrogate the cellular and molecular mechanisms underlying Alzheimer’s disease, and as an assay system to identify drugs that reverse or block disease phenotype. Prior studies have largely relied on high content imaging (HCI) to extract cellular features such as neurite length or branching, but these have not offered a robust/comprehensive means of relating readout to Aβ 1-42 concentrations. Here, we use a deep learning-based cell profiling technique to directly measure the impact of Aβ 1-42 on primary murine cortical neurons. The deep learning model achieved approximately 80% accuracy, compared to 54% for the cell phenotypic feature-based approach. The deep learning model could distinguish subtle neuronal morphological changes induced by a range of Aβ 1-42 concentration. When tested on a separate dataset, the accuracy remained comparable and dropped by only 2%. Our study demonstrates that deep learning-based cell profiling is superior to HCI-based feature extraction on neuronal morphology and it provides an alternative to a dose/response curve, where the modality of the response does not have to be pre-determined. Moreover, this approach could form the basis of a screening tool that can be applied to any cellular model where appropriate phenotypic markers based on genotypes and/or pathological insults are available.