Using the technique of differential cDNA library screening, a cDNA clone was isolated from an estrogen receptor (ER)-positive breast carcinoma cell line (MCF7) cDNA library based upon the overexpression of this gene compared to an ER-negative cell line (MDA-MB-231). Sequence analysis of this clone determined that it shared significant homology to G-protein-coupled receptors. This receptor, GPCR-Br, was abundantly expressed in the ER-positive breast carcinoma cell lines MCF7, T-47D, and MDA-MB-361. Expression was absent or minimal in the ER-negative breast carcinoma cell lines BT-20, MDA-MB-231, and HBL-100. GPCR-Br was ubiquitously expressed in human tissues examined but was most abundant in placenta. GPCR-Br expression was examined in 11 primary breast carcinomas. GPCR-Br was detected in all 4 ER-positive tumors and only 1 of 7 ER-negative tumors. Based upon PCR analysis in hybrid cell lines, the gene for GPCR-Br (HGMW-approved symbol GPR30) was mapped to chromosome 7p22. The pattern of expression of GPCR-Br indicates that this receptor may be involved in physiologic responses specific to hormonally responsive tissues.

We measured the insulin-stimulated amount of Akt1, Akt2, and Akt3 enzymatic activities in four breast cancer cell lines and three prostate cancer cell lines. In the estrogen receptor-deficient breast cancer cells and the androgen-insensitive prostate cells, the amount of Akt3 enzymatic activity was approximately 20–60-fold higher than in the cells that were estrogen- or androgen-responsive. In contrast, the levels of Akt1 and -2 were not increased in these cells. The increase in Akt3 enzyme activity correlated with an increase in both Akt3 mRNA and protein. In a prostate cancer cell line lacking the tumor suppressor PTEN (a lipid and protein phosphatase), the basal enzymatic activity of Akt3 was constitutively elevated and represented the major active Akt in these cells. Finally, reverse transcription-PCR was used to examine the Akt3 expression in 27 primary breast carcinomas. The expression levels of Akt3 were significantly higher in the estrogen receptor-negative tumors in comparison to the estrogen receptor-positive tumors. To see if the increase in Akt3 could be due to chromosomal abnormalities, the Akt3 gene was assigned to human chromosome 1q44 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid cell panel analyses. These results indicate that Akt3 may contribute to the more aggressive clinical phenotype of the estrogen receptor-negative breast cancers and androgen-insensitive prostate carcinomas. We measured the insulin-stimulated amount of Akt1, Akt2, and Akt3 enzymatic activities in four breast cancer cell lines and three prostate cancer cell lines. In the estrogen receptor-deficient breast cancer cells and the androgen-insensitive prostate cells, the amount of Akt3 enzymatic activity was approximately 20–60-fold higher than in the cells that were estrogen- or androgen-responsive. In contrast, the levels of Akt1 and -2 were not increased in these cells. The increase in Akt3 enzyme activity correlated with an increase in both Akt3 mRNA and protein. In a prostate cancer cell line lacking the tumor suppressor PTEN (a lipid and protein phosphatase), the basal enzymatic activity of Akt3 was constitutively elevated and represented the major active Akt in these cells. Finally, reverse transcription-PCR was used to examine the Akt3 expression in 27 primary breast carcinomas. The expression levels of Akt3 were significantly higher in the estrogen receptor-negative tumors in comparison to the estrogen receptor-positive tumors. To see if the increase in Akt3 could be due to chromosomal abnormalities, the Akt3 gene was assigned to human chromosome 1q44 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid cell panel analyses. These results indicate that Akt3 may contribute to the more aggressive clinical phenotype of the estrogen receptor-negative breast cancers and androgen-insensitive prostate carcinomas. Akt (also called protein kinase B) is a serine/threonine protein kinase that has been implicated in mediating a variety of biological responses including inhibiting apoptosis and stimulating cellular growth (reviewed in Ref. 1Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (969) Google Scholar). There are three mammalian isoforms of this enzyme, Akt1, Akt2, and Akt3 (1Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (969) Google Scholar). Akt1 was found to be the cellular homolog of a viral oncogene (v-Akt) that causes leukemia in mice (2Staal S.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987; 84: 5034-5037Crossref PubMed Scopus (646) Google Scholar). Further confirming the oncogenic potential of Akt, Akt1 was found to be overexpressed in 20% of gastric adenocarcinomas, and Akt2 was overexpressed in 3% of breast cancers, 15% of ovarian cancers, and 12% of pancreatic cancers because of gene amplification (2Staal S.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987; 84: 5034-5037Crossref PubMed Scopus (646) Google Scholar, 3Cheng J.Q. Ruggeri B. Klein W.M. Sonoda G. Altomare D.A. Watson D.K. Testa J.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 3636-3641Crossref PubMed Scopus (699) Google Scholar, 4Cheng J.Q. Godwin A.K. Bellacosa A. Taguchi T. Franke T.F. Hamilton T.C. Tsichlis P.N. Testa J.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 9267-9271Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar). Moreover, recent studies have documented that the tumor suppressor called PTEN or MMAC1 is actually a lipid phosphatase that can dephosphorylate phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (5Maehama T. Dixon J.E. J. Biol. Chem. 1998; 273: 13375-13378Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2601) Google Scholar). Since this lipid is one of the primary activators of Akt (1Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (969) Google Scholar), loss of PTEN results in a high basal activity of Akt in a variety of tumors including glioblastomas and prostate cancer lines, while reintroduction of PTEN suppresses Akt activity (6Stambolic V. Suzuki A. de la Pompa J.L. Brothers G.M. Mirtsos C. Sasaki T. Ruland J. Penninger J.M. Siderovski D.P. Mak T.W. Cell. 1998; 95: 29-39Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2107) Google Scholar, 7Haas-Kogan D. Shalev N. Wong M. Mills G. Yount G. Stokoe D. Curr. Biol. 1998; 8: 1195-1198Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 8Myers M.P. Pass I. Batty I.H. Van der Kaay J.S. Hemmings B.A. Wigler M.H. Downes C.P. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 13513-13518Crossref PubMed Scopus (1007) Google Scholar, 9Davies M.A. Lu Y. Sano T. Fang X. Tang P.L. Koul D. Bookstein R. Stokoe D.Y. Mills G.B. Steck P.A. Cancer Res. 1998; 58: 5285-5290PubMed Google Scholar, 10Li D.M. Sun H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15406-15411Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 11Wu X. Senechal K. Neshat M.S. Whang Y.E. Sawyers C.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15587-15591Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar, 12Li J. Simpson L. Takahashi M. Miliaresis C. Myers M.P. Tonks N. Parsons R. Cancer Res. 1998; 58: 5667-5672PubMed Google Scholar). Finally, much of the ability of PTEN to regulate the cell cycle and induce apoptosis appears to be mediated via its ability to regulate Akt enzymatic activity (6Stambolic V. Suzuki A. de la Pompa J.L. Brothers G.M. Mirtsos C. Sasaki T. Ruland J. Penninger J.M. Siderovski D.P. Mak T.W. Cell. 1998; 95: 29-39Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2107) Google Scholar, 7Haas-Kogan D. Shalev N. Wong M. Mills G. Yount G. Stokoe D. Curr. Biol. 1998; 8: 1195-1198Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 8Myers M.P. Pass I. Batty I.H. Van der Kaay J.S. Hemmings B.A. Wigler M.H. Downes C.P. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 13513-13518Crossref PubMed Scopus (1007) Google Scholar, 9Davies M.A. Lu Y. Sano T. Fang X. Tang P.L. Koul D. Bookstein R. Stokoe D.Y. Mills G.B. Steck P.A. Cancer Res. 1998; 58: 5285-5290PubMed Google Scholar, 10Li D.M. Sun H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15406-15411Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 11Wu X. Senechal K. Neshat M.S. Whang Y.E. Sawyers C.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15587-15591Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar, 12Li J. Simpson L. Takahashi M. Miliaresis C. Myers M.P. Tonks N. Parsons R. Cancer Res. 1998; 58: 5667-5672PubMed Google Scholar). Although the cDNA encoding rat Akt3 was identified over 3 years ago (13Konishi H. Kuroda S. Tanaka M. Matsuzaki H. Ono Y. Kameyama K. Haga T. Kikkawa U. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 526-534Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar), little information has been reported on this isoform. Like Akt1 and Akt2, Akt3 contains a pleckstrin homology domain, which is highly homologous to those of Akt1 and -2 and presumably binds phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate and is involved in activation of this enzyme (13Konishi H. Kuroda S. Tanaka M. Matsuzaki H. Ono Y. Kameyama K. Haga T. Kikkawa U. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 526-534Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar). Also, like these other isoforms, Akt3 contains a threonine residue in the same region as a critical regulatory phosphorylation site present in the activation loop of Akt1 and -2 and is phosphorylated by the same enzyme, PDK1, that phosphorylates this site in the other isoforms (14Walker K.S. Deak M. Paterson A. Hudson K. Cohen P. Alessi D.R. Biochem. J. 1998; : 299-308Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar). Unlike Akt1 and -2, Akt3 was initially reported to lack the second critical regulatory phosphorylation site in its carboxy tail (13Konishi H. Kuroda S. Tanaka M. Matsuzaki H. Ono Y. Kameyama K. Haga T. Kikkawa U. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 526-534Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar), although this has now been questioned (15Brodbeck D. Cron P. Hemmings B.A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 9133-9136Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (163) Google Scholar, 16Nakatani K. Sakaue H. Thompson D.A Weigel R.J. Roth R.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 906-910Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar). In addition, its tissue distribution appears to be more limited than that of Akt1 and -2, being primarily expressed in brain and testis (13Konishi H. Kuroda S. Tanaka M. Matsuzaki H. Ono Y. Kameyama K. Haga T. Kikkawa U. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 526-534Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar). In the present studies, we have examined the levels of Akt3 in both breast cancer and prostate cancer cell lines. We find that both the Akt3 enzymatic activity and mRNA are elevated in breast cancer cell lines and tumors that lack the estrogen receptor (ER) 1The abbreviations used are: ER, estrogen receptor; PCR, polymerase chain reaction; RT-PCR, reverse transcription-PCR; FISH, fluorescence in situ hybridization; HA, hemagglutinin. as well as in prostate cancer cell lines that are androgen-insensitive. These results indicate that Akt3 may contribute to the more aggressive clinical phenotype of these hormone-unresponsive breast and prostate carcinomas (17Chevallier B. Heintzmann F. Mosseri V. Dauce J.P. Bastit P. Graic Y. Brunelle P. Basuyau J.P. Comoz M. Asselain B. Cancer. 1988; 62: 2517-2524Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar, 18Henry J.A. Nicholson S. Farndon J.R. Westley B.R. May F.E. Br. J. Cancer. 1988; 58: 600-605Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar, 19Webber M.M. Bello D. Quader S. Prostate. 1996; 29: 386-394Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar, 20Soos G. Jones R.F. Haas G.P. Wang C.Y. Anticancer Res. 1997; 17: 4253-4258PubMed Google Scholar). Cell culture media and the RT-PCR kit were from Life Technologies, Inc. Total RNA and poly(A) RNA were isolated using the RNeasy kit from Qiagen (Chatsworth, CA) and the Fast Track 2.0 kit from Invitrogen (Carlsbad, CA), respectively. The primers for the Akt1, Akt2, Akt3, ER, PTEN/MMAC1, and β-actin were from Operon Technologies Inc. (Alameda, CA). [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol) was from NEN Life Science Products, and [α-32P]dCTP (3000 Ci/mmol) was from Amersham Pharmacia Biotech. The Akt substrate peptide (21Cross D.A.E. Alessi D.R. Cohen P. Andjelkovich M. Hemmings B.A. Nature. 1995; 378: 785-789Crossref PubMed Scopus (4376) Google Scholar) was synthesized in the Beckman-PAN facility (Stanford, CA). Nitrocellulose (Protran) and nylon (Nytran) membranes were from Schleicher & Schuell; the random priming kit, anti-HA monoclonal antibody (12CA5), and FuGene6 transfection reagent were from Roche Molecular Biochemicals; and anti-FLAG antibodies (M5) were from Sigma. A monoclonal antibody to the ER antibody (HC-20) was purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Rabbit polyclonal anti-Akt1 and anti-Akt3 antibodies directed against their respective pleckstrin homology domains were produced as described (22Krook A. Kawano Y. Song X.M. Efendic S. Roth R.A. WallbergHenriksson H. Zierath J.R. Diabetes. 1997; 46: 2110-2114Crossref PubMed Google Scholar). Anti-Akt2 antibodies were a gift of Dr. Birnbaum (23Calera M.R. Martinez C. Liu H. El Jack A.K. Birnbaum M.J. Pilch P.F. J. Biol. Chem. 1998; 273: 7201-7204Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (202) Google Scholar). A monoclonal anti-Akt1 antibody and a sheep anti-Akt3 antibody were from Transduction Laboratories (Lexington, KY) and Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY), respectively. Protein A-Sepharose and protein G-Sepharose were from Repligen (Cambridge, MA) and Amersham Pharmacia Biotech, respectively. The pECE construct coding the HA-tagged human Akt1 was as described (24Kohn A.D. Kovacina K.S. Roth R.A. EMBO J. 1995; 14: 4288-4295Crossref PubMed Scopus (319) Google Scholar). The pECE constructs encoding FLAG-tagged rat Akt2 and FLAG-tagged rat Akt3 (13Konishi H. Kuroda S. Tanaka M. Matsuzaki H. Ono Y. Kameyama K. Haga T. Kikkawa U. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 526-534Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar) were kindly provided by Dr. Kikkawa (Kobe, Japan). Human embryonic kidney 293T cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal calf serum at 37 °C, in an atmosphere containing 5% CO2. Cells were transfected using FuGene6 with 1 μg of plasmid DNA (HA-tagged Akt1-pECE, FLAG-tagged Akt2-pECE, FLAG-tagged Akt3-pECE, or vector without cDNA insert). Transfected 293T cells were extracted in 1 ml of lysis buffer containing 50 mmTris-HCl, pH 7.5, 150 mm NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 10% glycerol, 0.5 mm EDTA, 1 mm dithiothreitol, 1 mm benzamidine, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride. Lysates were centrifuged for 15 min at 15,000 ×g and immunoprecipitated with 2.5 μl of anti-Akt1, 5.0 μl of anti-Akt2, or 2.5 μl of anti-Akt3 antibodies. Immunoprecipitants were resolved on 12.5% SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. Akt2 and Akt3 were detected by Western blotting with anti-FLAG antibodies (1:1000), while Akt1 was detected with anti-HA antibodies (1:5000). Breast cancer cells (MCF-7, T-47D, MDA-MB-231, HBL-100) and prostate cancer cells (LNCaP, DU-145, PC-3) were maintained in a humidified atmosphere of 5% CO2 in RPMI 1640 medium supplemented with 5% fetal calf serum, 3 mm l-glutamine, 100 μg/ml streptomycin, and 100 units/ml penicillin. Cells were serum-starved overnight, stimulated with insulin, lysed in 1 ml of lysis buffer (50 mmTris-HCl, pH 7.5, 150 mm NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, 10% glycerol, 1 mm EDTA, 1 mm dithiothreitol, 1 mm benzamidine, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mg/ml bacitracin, 1 mmNa3VO4, 30 mm NaPPi, 10 mm NaF, 100 nm okadaic acid). Following centrifugation as above, the supernatants were incubated for 2 h at 4 °C with protein A-Sepharose beads coated with 2.5 μl of anti-Akt1, 5.0 μl of anti-Akt2, or 2.5 μl of anti-Akt3 antibodies. Immunoprecipitates were washed three times with the lysis buffer and twice with the kinase assay buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.5, 10 mm MgCl2, 1 mm dithiothreitol) and assayed using GSK-3 peptide (GRPRTSSFAEG) as substrate as described (25Kohn A.D. Barthel A. Kovacina K.S. Boge A. Wallach B. Summers S.A. Birnbaum M.J. Scott P.H. Lawrence Jr., J.C. Roth R.A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 11937-11943Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (272) Google Scholar). Following the kinase reaction, the phosphorylated peptide was separated from unincorporated [γ-32P]ATP on a 40% polyacrylamide gel containing 6 m urea. The phosphopeptide spots were excised and counted. Control assays using protein A-Sepharose beads preabsorbed with normal rabbit serum were run concurrently, and the values from these were subtracted from the experimental. Breast cancer cells and prostate cancer cells were homogenized with lysis buffer (as described above). After centrifugation at 15,000 × g for 30 min, the supernatants (1 mg of protein) were incubated for 2 h at 4 °C with either protein G-Sepharose beads coated with 5 μg of sheep anti-Akt3 antibodies or protein A-Sepharose beads coated with rabbit anti-Akt1 antibodies. The bound proteins were resolved on 12.5% SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. Akt3 was detected by Western blotting with the rabbit anti-Akt3 antibodies (1:1000), while Akt1 was detected with the monoclonal anti-Akt1 antibody (1:1000). Total RNA was extracted from tissue culture cells using RNAeasy (Qiagen). Primary human breast tumor tissues were collected fresh from mastectomy and biopsy specimens and snap frozen in liquid nitrogen (26Thompson D.A. Weigel R.J. Eur. J. Biochem. 1998; 252: 169-177Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar). Total RNA was isolated from these specimens using Trizol reagent (Life Technologies). The quality and quantity of the RNA were determined by measuring the absorbance at 260 and 280 nm. For RT-PCR studies, first-strand cDNA was synthesized from 1–5 μg of total RNA with an oligo(dT) primer and Super Script II reverse transcriptase (Life Technologies). Primers for PCR of human PTEN/MMAC1 were 5′-GGACGAACTGGTGTAATGATATG-3′ (forward primer) and 5′-TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC-3′ (reverse primer) to amplify a 671-bp fragment. Forward and reverse primers for human Akt1 were 5′-ATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3′ and 5′-GAGGCCGTCAGCCACAGTCTGGATG-3′, respectively; for human Akt2, 5′-ATGAATGAGGTGTCTGTCATCAAAGAAGGC-3′ and 5′-TGCTTGAGGCTGTTGGCGACC-3′, respectively; for human Akt3, 5′-ATGAGCGATGTTACCATTGT-3′ and 5′-CAGTCTGTCTGCTACAGCCTGGATA-3′, respectively; for the ER, 5′-GTGCCCTACTACCTGGAGAACGAGCCCAGC-3′ and 5′-AGCATAGTCATTGCACACTGCACAGTAGCG-3′, respectively; for β-actin, 5′-AGCAAGAGAGGCATCCTCACCCTGAAGTACC-3′ and 5′-CAGATTCTCCTTAATGTCACGCACGATTTCCC-3′, respectively. For Akt3, the human sequence was based on EST94063 (GenBankTM accession number AA381040) and EST753876 (GenBankTM accession numberAA479072). The conditions used for amplification were as follows: 94 °C for 1 min followed by 55 °C for 1 min and 72 °C for 1 min in a 50-μl reaction buffer containing cDNA generated from 20 ng of total RNA, 0.2 mm each dNTP, 0.2 μmeach primer, and 2.5 units of Taq polymerase (Life Technologies). Quantitation of the amount of PCR product after 30–33 cycles was performed after electrophoresis on 2% agarose gels and ethidium bromide staining. Poly(A) RNA was isolated from cancer cell lines using the Fast Track 2.0 kit (Invitrogen). Two μg of poly(A) RNA/lane were separated on a 1% agarose, 6.6% formaldehyde denaturing gel and transferred to nylon membranes using 20× SSC for 3 h and cross-linked by ultraviolet light. The blots were probed overnight at 42 °C with a random primed32P-labeled probe of either the human Akt3 PH domain (GenBankTM accession number AF135794) or the full-length human Akt1 (GenBankTM accession number M63167) as described previously (26Thompson D.A. Weigel R.J. Eur. J. Biochem. 1998; 252: 169-177Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar). The human Akt3 gene was localized by both fluorescence in situhybridization (FISH) and analyses of radiation cell hybrid panels. First, a human BAC library was screened by PCR (Research Genetics, Huntsville, AL). The forward and reverse primers were based on sequences in the 3′-untranslated region of an isolated Akt3 cDNA (16Nakatani K. Sakaue H. Thompson D.A Weigel R.J. Roth R.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 906-910Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar). The isolated BAC was confirmed by sequencing to encode Akt3 and then used for FISH (Genome Systems, Inc., St. Louis, MO). The radiation hybrid cell panel (Gene Bridge 4 Mapping Panel; Research Genetics, Huntsville, AL) was screened by PCR. The primer pair used for amplification was 5′-TCTTACACATAGCAGGGGCACCTTC-3′ (forward primer) and 5′-CAGTAGCAGCAACAGCATGAGACC-3′ (reverse primer), derived from the 3′-untranslated region of Akt3 (16Nakatani K. Sakaue H. Thompson D.A Weigel R.J. Roth R.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 257: 906-910Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar). PCR products, 168 base pairs in length, were identified by electrophoresis on a 2% agarose gel. To measure the amount of Akt1, -2, and -3 in cells, we utilized distinct antibodies for each isoform (see “Experimental Procedures”). To test the specificity of these antibodies, we first examined them for their ability to precipitate epitope-tagged expressed forms of these enzymes. Each antibody was found to preferentially precipitate its intended target, demonstrating their relative specificity (Fig. 1A). These antibodies were then utilized to examine the levels of the three isoforms of Akt in four breast cancer cell lines, two which express the ER (MCF-7, T-47D) and two which do not express the ER (MDA-MB-231, HBL-100). Cells were treated with buffer or insulin (to maximally stimulate the Akt enzymatic activity) and lysed, and the lysates were precipitated with antibodies to the three isoforms. An insulin-stimulated Akt1 activity was present in all four cell lines (Fig. 1B). Almost no detectable Akt2 activity was measured with or without insulin in all four cell lines (data not shown). Akt3 activity was 30–60-fold higher in the two ER-negative cell lines than in the two ER-positive cell lines (Fig. 1B). We then measured the activity of the Akt isoforms in three prostate cancer cell lines, one of which is androgen-sensitive (LNCaP) and two of which are androgen-insensitive (DU-145 and PC-3). Detectable Akt1 activity was present in all three cell lines (Fig. 1C), while little Akt2 activity was found (data not shown). Akt3 activity was 20–40-fold greater in the two androgen-insensitive cells than in the androgen-sensitive cells (Fig. 1C). PC-3, which does not contain PTEN (Ref. 27Whang Y.E. Wu X. Suzuki H. Reiter R.E. Tran C. Vessella R.L. Said J.W. Isaacs W.B. Sawyers C.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 5246-5250Crossref PubMed Scopus (563) Google Scholar; confirmed with the cells used in the present work), exhibited a 40–100-fold elevated basal level of Akt3 activity in comparison with the DU-145 cells. LNCaP, which also does not have a functional PTEN, exhibited a constitutively active Akt1. To determine whether the Akt3 enzymatic activities measured above reflected the levels of the Akt3 protein present in these different cells, we utilized a commercially available sheep antibody to Akt3 to precipitate the protein and then Western blotted these precipitates with the rabbit polyclonal antibody to Akt3. As controls, the levels of Akt1 protein and the ER in these cells were also monitored by immunoprecipitation and Western blotting. The two ER-negative cells (MDA-MB-231, HBL-100) both contained an Akt3 band, whereas the two ER-positive cells (MCF-7, T-47D) did not contain a detectable Akt3 band (Fig. 2A). In contrast, all four cell lines contained an Akt1 band. Similar studies were then performed on the prostate cancer cell lines. The two androgen-insensitive cell lines (PC-3 and DU-145) were both found to contain Akt3, whereas no detectable Akt3 band was observed in the androgen-sensitive cells, LNCaP (Fig. 2B). Again, all three cell lines contained an Akt1 band. To determine whether the increase in Akt3 enzyme activity and protein was due to an increase in Akt3 mRNA, Northern blot analyses was performed. Akt3 mRNA was found to be greatly elevated in two ER-negative breast cancer cell lines (MDA-MB-231, HBL-100) and in a breast cancer cell line (BT-20) that exhibits very low levels of ER expression in comparison with the five ER-positive cells tested (Fig. 3). Akt3 transcripts of 7.7, 5.3, and 1.4 kilobase pairs were observed. In contrast, no specific pattern was observed with Akt1 mRNA levels, with the greatest amounts being present in MCF-7, MDA-MB-361, BT-474, and HBL-100 (Fig. 3). To assess Akt3 levels in primary human breast tumor tissues, semiquantitative RT-PCR was utilized. Controls first verified that this method also demonstrated elevated levels of the Akt3 mRNA in the two breast cancer cell lines that are ER-negative (the MDA-MB-231 and HBL-100 cells) (Fig. 2A). Using this method, we also found elevated levels of Akt3 mRNA in the two androgen-insensitive prostate cancer cell lines (DU-145 and PC-3) in comparison with the androgen-sensitive cells (Fig. 2B). Twenty-seven primary breast carcinomas were then analyzed. Concurrently, the levels of Akt1, Akt2, Akt3, β-actin, and ER mRNA were also measured (Fig. 4). There was a significant correlation between a low level of ER mRNA and elevated Akt3 mRNA (p = 0.04) in these samples, although some samples with ER did contain Akt3 (Fig. 4A). In contrast, there was no significant correlation between the ER mRNA levels and Akt1 mRNA (p = 0.69) (Fig. 4B) or Akt2 mRNA (p = 0.58) (data not shown). By RT-PCR, human mammary epithelial cells had high levels of Akt3 and low levels of ER (data not shown). Since many oncogenes are activated by chromosomal rearrangements and/or gene amplifications, we determined the chromosomal localization of the Akt3 gene. We first used radiation hybrid mapping. The GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics) was screened by PCR using primers directed to the 3′-untranslated region, which gave a product with human genomic DNA but not with Chinese hamster DNA. PCR product was identified with the DNA of 22 of the 93 RH cell lines, and Akt3 was placed on chromosome 1, 5.45 cR from D1S2842 and 20.8 cR from AFM155XC11. These results indicated that the human Akt3 gene is localized to human chromosome 1q44. To verify these results, a human genomic clone for Akt3 was utilized for FISH (Fig. 5). Of 80 checked metaphase cells, 75 showed that the Akt3 gene was localized to the terminus of the long arm of chromosome 1, in a position corresponding to band 1q44. Thus, the results obtained by in situ hybridization and radiation hybrid panel were in accord. A wide variety of studies have implicated the serine/threonine kinase called Akt in the transformation of cells (1Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (969) Google Scholar, 2Staal S.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987; 84: 5034-5037Crossref PubMed Scopus (646) Google Scholar, 3Cheng J.Q. Ruggeri B. Klein W.M. Sonoda G. Altomare D.A. Watson D.K. Testa J.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 3636-3641Crossref PubMed Scopus (699) Google Scholar, 4Cheng J.Q. Godwin A.K. Bellacosa A. Taguchi T. Franke T.F. Hamilton T.C. Tsichlis P.N. Testa J.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 9267-9271Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar, 28Aoki M. Batista O. Bellacosa A. Tsichlis P. Vogt P.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 14950-14955Crossref PubMed Scopus (258) Google Scholar). This kinase can both inhibit apoptosis in cells as well as stimulate their growth (reviewed in Ref. 1Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (969) Google Scholar). A mutant form of this enzyme was found to be the transforming component of AKT8 retrovirus (2Staal S.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987; 84: 5034-5037Crossref PubMed Scopus (646) Google Scholar). In addition, a tumor suppressor, called PTEN or MMAC1, regulates the basal activity of this enzyme and induces cell death, which is rescued by constitutively active forms of the enzyme (5Maehama T. Dixon J.E. J. Biol. Chem. 1998; 273: 13375-13378Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2601) Google Scholar, 6Stambolic V. Suzuki A. de la Pompa J.L. Brothers G.M. Mirtsos C. Sasaki T. Ruland J. Penninger J.M. Siderovski D.P. Mak T.W. Cell. 1998; 95: 29-39Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2107) Google Scholar, 7Haas-Kogan D. Shalev N. Wong M. Mills G. Yount G. Stokoe D. Curr. Biol. 1998; 8: 1195-1198Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 8Myers M.P. Pass I. Batty I.H. Van der Kaay J.S. Hemmings B.A. Wigler M.H. Downes C.P. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 13513-13518Crossref PubMed Scopus (1007) Google Scholar, 9Davies M.A. Lu Y. Sano T. Fang X. Tang P.L. Koul D. Bookstein R. Stokoe D.Y. Mills G.B. Steck P.A. Cancer Res. 1998; 58: 5285-5290PubMed Google Scholar, 10Li D.M. Sun H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15406-15411Crossref PubMed Scopus (438) Google Scholar, 11Wu X. Senechal K. Neshat M.S. Whang Y.E. Sawyers C.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15587-15591Crossref PubMed Scopus (595) Google Scholar, 12Li J. Simpson L. Takahashi M. Miliaresis C. Myers M.P. Tonks N. Parsons R. Cancer Res. 1998; 58: 5667-5672PubMed Google Scholar). Since three isoforms of Akt have been identified, it is not clear which of these isoforms is involved (1Coffer P.J. Jin J. Woodgett J.R. Biochem. J. 1998; 335: 1-13Crossref PubMed Scopus (969) Google Scholar). In several cancers, an increase in Akt2 protein and mRNA was observed due to gene amplification (2Staal S.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987; 84: 5034-5037Crossref PubMed Scopus (646) Google Scholar, 3Cheng J.Q. Ruggeri B. Klein W.M. Sonoda G. Altomare D.A. Watson D.K. Testa J.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 3636-3641Crossref PubMed Scopus (699) Google Scholar, 4Cheng J.Q. Godwin A.K. Bellacosa A. Taguchi T. Franke T.F. Hamilton T.C. Tsichlis P.N. Testa J.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 9267-9271Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar). In the present studies, we have examined the levels of the three Akt isoforms in various breast cancer lines as well as prostate cancer cells. In all four breast cancer cell lines, Akt1 was present and stimulated by insulin treatment. In contrast, very little Akt2 enzymatic activity was detected. Most importantly, Akt3 enzymatic activity was 30–60-fold higher in the two ER-negative cell lines (MDA-MB-231 and HBL-100) than in the two ER-positive cell lines (MCF-7 and T-47D). Similarly, Akt3 enzymatic activity was 20–40-fold higher in two androgen-insensitive prostate cancer cell lines (DU-145 and PC-3) in comparison with an androgen-sensitive prostate cancer cell line (LNCaP). These findings indicate that the increases in Akt3 isoform may be more generally true for other cancers as well. In PC-3, a line of cells that lacks the lipid phosphatase PTEN, a markedly elevated basal level of Akt enzymatic activity was observed. This basal activity was predominantly contributed by Akt3. These results indicate that in some tumors that lack PTEN, the increase in basal activity of Akt may be primarily due to Akt3. The higher level of Akt3 enzymatic activity in both the ER-negative breast cancer cells and the androgen-insensitive prostate cancer cells correlates with an increased expression of Akt3 protein and mRNA. The increase in Akt3 mRNA in these cell lines did not appear to be due to gene amplification in the cells tested (data not shown). Also, the chromosomal region identified as containing the Akt3 gene, 1q44, has not been found to be amplified in different cancers (29Knuutila S. Björkqvist A.-M. Autio K. Tarkkanen M. Wolf M. Monni O. Szymanska J. Larramendy M.L. Tapper J. Pere H. El Rifai W. Hemmer S. Wasenius V.-M. Vidgren V. Zhu Y. Am. J. Pathol. 1998; 152: 1107-1123PubMed Google Scholar). However, it is close to a region (1q42.2–43) that has been identified as predisposing individuals to early onset prostate cancer (30Berthon P. Valeri A. Cohen-Akenine A. Drelon E. Paiss T. Wohr G. Latil A. Millasseau P. Mellah I. Cohen N. Blanche H. BellaneChantelot C. Demenais F. Teillac P. Le Duc A. de Petriconi R. Hautmann R. Chumakov I. Bachner L. Maitland N.J. Lidereau R. Vogel W. Fournier G. Mangin P. Cohen P. Cussenot O. Am. J. Hum. Genet. 1998; 62: 1416-1424Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (304) Google Scholar). The inverse correlation between the ER levels and Akt3 levels observed in the breast cancer cell lines also appeared to persist in a panel of 27 primary breast carcinomas, although several samples did show a divergence from this pattern. It is possible that the divergence in some tumors may represent nonfunctional ER and/or tissue heterogeneity. It is also possible that the ER does not directly repress the expression of the Akt3 gene. In support of this latter hypothesis, attempts to express the ER in the ER-negative cells did not result in a decrease in the levels of Akt3 mRNA (data not shown), suggesting a more complex interaction. Alternatively, it is possible that since ER-negative breast carcinomas are generally less well differentiated then ER-positive cells (31Fisher E.R. Sass R. Fisher B. Cancer. 1987; 59: 1554-1559Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar), the increase in Akt3 may be due to the general change in these cells to this less differentiated phenotype. In either case, since hormone-unresponsive breast and prostate carcinomas are generally more aggressive clinically with higher metastatic potential than hormone-responsive tumors (17Chevallier B. Heintzmann F. Mosseri V. Dauce J.P. Bastit P. Graic Y. Brunelle P. Basuyau J.P. Comoz M. Asselain B. Cancer. 1988; 62: 2517-2524Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar, 18Henry J.A. Nicholson S. Farndon J.R. Westley B.R. May F.E. Br. J. Cancer. 1988; 58: 600-605Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar, 19Webber M.M. Bello D. Quader S. Prostate. 1996; 29: 386-394Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar, 20Soos G. Jones R.F. Haas G.P. Wang C.Y. Anticancer Res. 1997; 17: 4253-4258PubMed Google Scholar), it is possible that Akt3 contributes to this phenotype. For example, the ability of Akt to inhibit apoptosis induced by a wide variety of agents could make the tumors with high Akt3 levels more resistant to chemotherapeutic treatments. Furthermore, the ability of Akt to inhibit death of cells after detachment from the extracellular matrix could promote the frequency of metastasis (32Khwaja A. Rodriguez-Viciana P. Wennstrom S. Warne P.H. Downward J. EMBO J. 1997; 16: 2783-2793Crossref PubMed Scopus (939) Google Scholar). We thank Dr. Morris Birnbaum (University of Pennsylvania) for the antibodies to Akt2, Dr. Kikkawa (Kobe University) for the rat Akt2 and Akt3 cDNAs, and Dr. David Feldman (Stanford University) for the three prostate cancer cell lines. Breast cancer tissue was obtained from Dr. H. Feiner at the Breast Cancer Resource of the Department of Pathology, New York University Medical Center.

Constitutively active mutations in the Gαi2 and GαoA subunits of heterotrimeric G proteins have been identified in several human cancers including breast cancer, but their functional significance in tumorigenesis and metastasis has not been well characterized. In this study, we show that expression of the constitutively active GαoAR243H and Gαi2R179C mutants alone was insufficient to induce mammary tumor formation in mice. However, in transgenic mouse models of breast cancer induced by Neu expression or PTEN loss, we found that the Gαi2R179C mutant enhanced spontaneous lung metastasis while having no effect on primary tumor initiation and growth. Additionally, we observed that ectopic expression of the GαoAR243H and Gαi2R179C mutants in tumor cells promote cell migration in vitro as well as dissemination into multiple organs in vivo by activating c-Src signaling. Thus, our study uncovers a critical function of Gαi/o signaling in accelerating breast cancer metastasis via the c-Src pathway. This work is clinically significant, as it can potentially pave the way to personalized therapies for patients who present with active Gαi/o mutations or elevated Gαi/o signaling by targeting c-Src to inhibit breast cancer metastasis.

Abstract The mismatch repair (MMR) pathway is known as a tumor suppressive pathway and genes involved in MMR are commonly mutated in hereditary colorectal or other cancer types. However, the function of MMR genes/proteins in breast cancer progression and metastasis are largely unknown. We found that MSH2, but not MLH1, is highly enriched in basal-like breast cancer (BLBC) and that its protein expression is inversely correlated with overall survival time (OS). MSH2 expression is frequently elevated due to genomic amplification or gain-of-expression in BLBC, which results in increased MSH2 protein to pair with MSH6 (collectively referred to as MutSα). Genetic deletion of MSH2 or MLH1 results in a contrasting phenotype in metastasis, with MSH2 -deletion leading to reduced metastasis and MLH1 -deletion to enhanced liver or lung metastasis. Mechanistically, MSH2 -deletion induces the expression of a panel of chemokines in BLBC via epigenetic and/or transcriptional regulation, which leads to an immune reactive tumor microenvironment (TME) and elevated immune cell infiltrations. MLH1 is not correlated with chemokine expression and/or immune cell infiltration in BLBC, but its deletion results in strong accumulation of neutrophils that are known for metastasis promotion. Our study supports the differential functions of MSH2 and MLH1 in BLBC progression and metastasis, which challenges the paradigm of the MMR pathway as a universal tumor suppressive mechanism.

Abstract G protein coupled receptors (GPCRs) are among the most desirable drug targets for human disease. Although GPCR dysfunction drives the development and progression of many tumors including breast cancer (BC), targeting individual GPCRs has limited efficacy as a cancer therapy because numerous GPCRs are activated. In this study, we sought a new way of blocking GPCR activation in HER2 + -BC by targeting a subgroup of GPCRs that couple to G i/o proteins (G i/o -GPCRs). Using cell lines and transgenic mouse models, we showed in mammary epithelial cells, HER2 hyperactivation altered GPCR expression, particularly, G i/o -GPCRs. G i/o -GPCR stimulation transactivated EGFR and HER2, which in turn activated the PI3K/AKT and Src pathways. Uncoupling G i/o -GPCRs from cognate G i/o proteins by pertussis toxin (PTx) inhibited BC cell proliferation and migration in vitro and suppressed HER2-driven tumor formation and metastasis in vivo . Moreover, targeting G i/o -GPCR signaling via PTx, PI3K, or Src inhibitors enhanced HER2-targeted therapy. These results indicate that HER2 hyperactivation in BC cells drives aberrant G i/o -GPCR signaling, and G i/o -GPCR signals converge on PI3K/AKT and Src signaling pathways to promote cancer progression and the development of resistance to HER2-targeted therapy. Our findings suggest a new way to pharmacologically deactivate GPCR signaling to block tumor growth and enhance therapeutic efficacy.

Purpose: To determine if dual-degree training [ie, completion of a National Institutes of Health (NIH)-funded MD/PhD program], among other professional development and demographic variables, predicted academic productivity (eg, K-to-R conversion, number of publications, etc.) among early-career surgeon-scientists. Methods: We analyzed publicly available data from the National MD/PhD Program Outcomes Study and the Association of American Medical Colleges Graduate Medical Education Track database to identify trends in the number and proportion of MD/PhD graduates pursuing surgical specialties. NIH Research Portfolio Online Reporting Tool Expenditures and Results was interrogated to identify a cohort of early-career academic surgeon-scientists receiving K-awards from 2011 to 2021. Results: The total number of MD/PhD program graduates completing Graduate Medical Education training increased each decade after the Medical Scientist Training Program was established by the National Institute of General Medical Sciences, but the proportion completing surgical specialties did not change significantly ( P = 0.96) from 1965 to 2014. More recent residency match trends demonstrate an increase in both the proportion and number of MD/PhD graduates entering surgical specialties, with 21.5% entering surgical residency training in 2020. Among 476 early-career academic surgeon-scientists receiving K-awards at 70 institutions, 27% were faculty members at only 4 universities, suggesting that federally funded surgeon-scientists are concentrated at a small number of institutions. Although MD/PhD graduates represented only 2.3% of active surgical residents from 2011 to 2020, they constituted a much higher fraction of K-awardees (29%). Of 296 surgeon-scientists who completed K-awards, 35% successfully obtained an R01-equivalent award. Conclusions: These findings emphasize the need for comprehensive career development and institutional resources to support early-career surgeon-scientists.

Objective: We sought to determine the premium associated with a career in academic surgery, as measured by compensation normalized to the work relative value unit (wRVU). Background: An academic surgical career, embodying innovation and mentorship, offers intrinsic rewards, but is not well monetized. We know compensation for academic surgeons is less than their non-academic counterparts, but the value of clinical effort, as normalized to the wRVU, between academic and non-academic surgeons has not been well characterized. Thus, we analyzed the variations in the valuation of academic and non-academic surgical work from 2010 to 2022. Methods: We utilized Medical Group Management Association Provider Compensation data from 2010, 2014, 2018, and 2022 to compare academic and non-academic surgeons. We analyzed raw total cash compensation (TCC), wRVU, TCC per wRVU (TCC/wRVU), and TCC to collections (TCCtColl). We calculated collections per wRVU (Coll/wRVU). We adjusted TCC and TCCtColl for inflation using the Consumer Price Index. Linear modeling for trend analysis was performed. Results: Compared to non-academic, academic surgeons had lower TCC (2010: $500,415.0±23,666 vs. $631,515.5±23,948.2, -21%; 2022: $564,789.8±23,993.9 vs. $628,247.4±15,753.2, -10%), despite higher wRVUs (2022: 9,109.4±474.9 vs. 8,062.7±252.7) and higher Coll/wRVU (2022: 76.68±8.15 vs. 71.80±6.10). Trend analysis indicated TCC will converge in 2038 at an estimated $660,931. Conclusions: In 2022, academic surgeons had more clinical activity and superior organizational revenue capture, despite less total and normalized clinical compensation. Based on TCC/wRVUs, academia charges a premium of 16% over non-academic surgery. However, trend analysis suggests that TCC will converge within the next twenty years.

Summary Cancer stem cells (CSCs) are a small subpopulation of cells within tumors that are resistant to anti-tumor therapies, making them a likely origin of tumor relapse after treatment. In many cancers including breast cancer, CSC function is regulated by G protein-coupled receptors (GPCRs), making GPCR signaling an attractive target for new therapies designed to eradicate CSCs. Yet, CSCs overexpress multiple GPCRs that are redundant in maintaining CSC function, so it is unclear how to target all the various GPCRs to prevent relapse. Here, in a model of HER2+ breast cancer (i.e., transgenic MMTV-Neu mice), we were able to block tumorsphere- and tumor-forming capability of CSCs by targeting GPCRs coupled to Gi/o proteins (Gi/o-GPCRs). Similarly, in HER2+ breast cancer cells, blocking signaling downstream of Gi/o-GPCRs in the PI3K/AKT and Src pathways also enhanced HER2-targeted elimination of CSCs. In a proof-of-concept study, when CSCs were selectively ablated (via a suicide gene construct), loss of CSCs from HER2+ breast cancer cell populations mimicked the effect of targeting Gi/o-GPCR signaling, suppressing their capacity for tumor initiation and progression and enhancing HER2-targeted therapy. Thus, targeting Gi/o-GPCR signaling in HER2+ breast cancer is a promising approach for eradicating CSCs, enhancing HER2+ targeted therapy and blocking tumor reemergence.