Summary

 Exercise is essential in regulating energy metabolism and whole-body insulin sensitivity. To explore the exercise signaling network, we undertook a global analysis of protein phosphorylation in human skeletal muscle biopsies from untrained healthy males before and after a single high-intensity exercise bout, revealing 1,004 unique exercise-regulated phosphosites on 562 proteins. These included substrates of known exercise-regulated kinases (AMPK, PKA, CaMK, MAPK, mTOR), yet the majority of kinases and substrate phosphosites have not previously been implicated in exercise signaling. Given the importance of AMPK in exercise-regulated metabolism, we performed a targeted in vitro AMPK screen and employed machine learning to predict exercise-regulated AMPK substrates. We validated eight predicted AMPK substrates, including AKAP1, using targeted phosphoproteomics. Functional characterization revealed an undescribed role for AMPK-dependent phosphorylation of AKAP1 in mitochondrial respiration. These data expose the unexplored complexity of acute exercise signaling and provide insights into the role of AMPK in mitochondrial biochemistry.

Abstract Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is an inherited heart muscle disease; characterised by left ventricular wall thickening, cardiomyocyte disarray, and fibrosis, and is associated with arrhythmias, heart failure and sudden death. However, it is unclear to what extent the electrophysiological disturbances that lead to sudden death occur secondary to the structural changes in the myocardium, or as a result of intrinsic properties of the HCM cardiomyocyte. In this study, we used an induced pluripotent stem cell model of the Arg403Gln variant in myosin heavy chain 7 ( MYH7 ) to study ‘tissue level’ electrophysiological properties of HCM cardiomyocytes. For the first time, we show significant slowing of conduction velocity and an increase in local spatial dispersion of repolarisation - both well-established substrates for arrhythmia - in monolayers of HCM cardiomyocytes. Analysis of rhythmonome protein expression in R403Q cardiomyocytes revealed dramatically reduced connexin-43, sodium channels, and inward rectifier channels – a three-way hit that combines to reduce electrotonic coupling between HCM cardiomyocytes and slow cardiac conduction. Our data therefore represent a novel, biophysical basis for arrhythmia in HCM, that is intrinsic to cardiomyocyte electrophysiology. Later in the progression of the disease, these proarrhythmic electrical phenotypes may be accentuated by fibrosis and myocyte disarray to contribute to sudden death in HCM patients.

Obesity is characterized by increased output of inflammatory compounds from adipose tissue. Whilst the relative contribution of adipocytes and resident macrophages to this phenomenon is debated, there is no doubt that the secretions of each cell type can stimulate the expression of inflammatory genes in the other. We hypothesized that mechanisms must exist to prevent an escalating positive feedback loop between the two cell types, so that after an initial exposure to macrophage secretions, adipocytes would become desensitized to subsequent inflammatory stimulation. We used microarrays to investigate the response of 3T3-L1 adipocytes to macrophage secretions (macrophage conditioned medium, MCM). MCM caused a rapid (<4 hours) and high amplitude (over 100-fold) rise in the expression of several inflammatory genes. For some genes, generally cytokines, expression returned to basal levels within 24 h following removal of the MCM, but other transcripts, notably those for acute phase proteins and extracellular matrix remodeling proteins, remained highly expressed even during the washout period. Unexpectedly, some cytokine genes (e.g., iNOS, IL-6) showed an enhanced expression to a second exposure of MCM, illustrating that the transcriptome response of 3T3-L1 adipocytes retains a memory to the first stimulus. We characterized the parameters that give rise to the memory phenomenon, finding that additional stimuli do not augment or abrogate the effect. The memory is preserved for several days after the initial exposure and it is not due to a change in sensitivity to the MCM but, rather, a change in the capacity of the signal-target system. The possible mechanisms of the memory are discussed, along with the physiological ramifications should the phenomenon be replicated in vivo.