To determine the efficacy of a probiotic drink containing Lactobacillus for the prevention of any diarrhoea associated with antibiotic use and that caused by Clostridium difficile.Randomised double blind placebo controlled study.135 hospital patients (mean age 74) taking antibiotics. Exclusions included diarrhoea on admission, bowel pathology that could result in diarrhoea, antibiotic use in the previous four weeks, severe illness, immunosuppression, bowel surgery, artificial heart valves, and history of rheumatic heart disease or infective endocarditis.Consumption of a 100 g (97 ml) drink containing Lactobacillus casei, L bulgaricus, and Streptococcus thermophilus twice a day during a course of antibiotics and for one week after the course finished. The placebo group received a longlife sterile milkshake.occurrence of antibiotic associated diarrhoea. Secondary outcome: presence of C difficile toxin and diarrhoea.7/57 (12%) of the probiotic group developed diarrhoea associated with antibiotic use compared with 19/56 (34%) in the placebo group (P=0.007). Logistic regression to control for other factors gave an odds ratio 0.25 (95% confidence interval 0.07 to 0.85) for use of the probiotic, with low albumin and sodium also increasing the risk of diarrhoea. The absolute risk reduction was 21.6% (6.6% to 36.6%), and the number needed to treat was 5 (3 to 15). No one in the probiotic group and 9/53 (17%) in the placebo group had diarrhoea caused by C difficile (P=0.001). The absolute risk reduction was 17% (7% to 27%), and the number needed to treat was 6 (4 to 14).Consumption of a probiotic drink containing L casei, L bulgaricus, and S thermophilus can reduce the incidence of antibiotic associated diarrhoea and C difficile associated diarrhoea. This has the potential to decrease morbidity, healthcare costs, and mortality if used routinely in patients aged over 50.National Research Register N0016106821.

The ability to acquire iron in vivo is essential for most microbial pathogens. Here we show that Aspergillus fumigatus does not have specific mechanisms for the utilization of host iron sources. However, it does have functional siderophore-assisted iron mobilization and reductive iron assimilation systems, both of which are induced upon iron deprivation. Abrogation of reductive iron assimilation, by inactivation of the high affinity iron permease (FtrA), has no effect on virulence in a murine model of invasive aspergillosis. In striking contrast, A. fumigatus l-ornithine-N 5-monooxygenase (SidA), which catalyses the first committed step of hydroxamate-type siderophore biosynthesis, is absolutely essential for virulence. Thus, A. fumigatus SidA is an essential virulence attribute. Combined with the absence of a sidA ortholog—and the fungal siderophore system in general—in mammals, these data demonstrate that the siderophore biosynthetic pathway represents a promising new target for the development of antifungal therapies.

Invasive pulmonary aspergillosis is increasingly reported in patients with influenza admitted to the intensive care unit (ICU). Classification of patients with influenza-associated pulmonary aspergillosis (IAPA) using the current definitions for invasive fungal diseases has proven difficult, and our aim was to develop case definitions for IAPA that can facilitate clinical studies. A group of 29 international experts reviewed current insights into the epidemiology, diagnosis and management of IAPA and proposed a case definition of IAPA through a process of informal consensus. Since IAPA may develop in a wide range of hosts, an entry criterion was proposed and not host factors. The entry criterion was defined as a patient requiring ICU admission for respiratory distress with a positive influenza test temporally related to ICU admission. In addition, proven IAPA required histological evidence of invasive septate hyphae and mycological evidence for Aspergillus. Probable IAPA required the detection of galactomannan or positive Aspergillus culture in bronchoalveolar lavage (BAL) or serum with pulmonary infiltrates or a positive culture in upper respiratory samples with bronchoscopic evidence for tracheobronchitis or cavitating pulmonary infiltrates of recent onset. The IAPA case definitions may be useful to classify patients with COVID-19-associated pulmonary aspergillosis (CAPA), while awaiting further studies that provide more insight into the interaction between Aspergillus and the SARS-CoV-2-infected lung. A consensus case definition of IAPA is proposed, which will facilitate research into the epidemiology, diagnosis and management of this emerging acute and severe Aspergillus disease, and may be of use to study CAPA.

BackgroundSlow and cumbersome laboratory diagnostics for Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) risk delayed treatment and poor patient outcomes. Whole-genome sequencing (WGS) could potentially provide a rapid and comprehensive diagnostic solution. In this prospective study, we compare real-time WGS with routine MTBC diagnostic workflows.MethodsWe compared sequencing mycobacteria from all newly positive liquid cultures with routine laboratory diagnostic workflows across eight laboratories in Europe and North America for diagnostic accuracy, processing times, and cost between Sept 6, 2013, and April 14, 2014. We sequenced specimens once using local Illumina MiSeq platforms and processed data centrally using a semi-automated bioinformatics pipeline. We identified species or complex using gene presence or absence, predicted drug susceptibilities from resistance-conferring mutations identified from reference-mapped MTBC genomes, and calculated genetic distance to previously sequenced UK MTBC isolates to detect outbreaks. WGS data processing and analysis was done by staff masked to routine reference laboratory and clinical results. We also did a microcosting analysis to assess the financial viability of WGS-based diagnostics.FindingsCompared with routine results, WGS predicted species with 93% (95% CI 90–96; 322 of 345 specimens; 356 mycobacteria specimens submitted) accuracy and drug susceptibility also with 93% (91–95; 628 of 672 specimens; 168 MTBC specimens identified) accuracy, with one sequencing attempt. WGS linked 15 (16% [95% CI 10–26]) of 91 UK patients to an outbreak. WGS diagnosed a case of multidrug-resistant tuberculosis before routine diagnosis was completed and discovered a new multidrug-resistant tuberculosis cluster. Full WGS diagnostics could be generated in a median of 9 days (IQR 6–10), a median of 21 days (IQR 14–32) faster than final reference laboratory reports were produced (median of 31 days [IQR 21–44]), at a cost of £481 per culture-positive specimen, whereas routine diagnosis costs £518, equating to a WGS-based diagnosis cost that is 7% cheaper annually than are present diagnostic workflows.InterpretationWe have shown that WGS has a scalable, rapid turnaround, and is a financially feasible method for full MTBC diagnostics. Continued improvements to mycobacterial processing, bioinformatics, and analysis will improve the accuracy, speed, and scope of WGS-based diagnosis.FundingNational Institute for Health Research, Department of Health, Wellcome Trust, British Colombia Centre for Disease Control Foundation for Population and Public Health, Department of Clinical Microbiology, Trinity College Dublin.

Abstract Infections caused by opportunistic fungal pathogens are increasingly resistant to first-line azole antifungal drugs. However, despite its clinical importance, little is known about the extent to which susceptible patients acquire infection from drug resistant genotypes in the environment. Here, we present a population genomic analysis of the mould Aspergillus fumigatus from across the United Kingdom and Republic of Ireland. First, we show occurrences where azole resistant isolates of near identical genotypes were obtained from both environmental and clinical sources, indicating with high confidence the infection of patients with resistant isolates transmitted from the environment. Second, we find that the fungus is structured into two clades (‘A’ and ‘B’) with little interclade recombination and the majority of environmental azole resistance genetically clustered inside Clade A. Genome-scans show the impact of selective sweeps across multiple regions of the genome. These signatures of positive selection are seen in regions containing canonical genes encoding fungicide resistance in the ergosterol biosynthetic pathway, whilst other regions under selection have no defined function. Phenotyping identified genes in these regions that could act as modifiers of resistance showing the utility of reverse genetic approaches to dissect the complex genomic architecture of fungal drug resistance. Understanding the environmental drivers and genetic basis of evolving fungal drug resistance needs urgent attention, especially in light of increasing numbers of patients with severe viral respiratory tract infections who are susceptible to opportunistic fungal superinfections.

Abstract The opportunistic fungus Aspergillus fumigatus has been found to cause coinfections in patients with severe SARS-CoV-2 virus infection, leading to COVID-19-associated pulmonary aspergillosis (CAPA). The CAPA all-cause mortality rate is approximately 50% and may be complicated by azole-resistance. Genomic epidemiology can help shed light on the genetics of A. fumigatus causing CAPA including the prevalence of alleles that are associated with azole-resistance. Here, a population genomic analysis of 21 CAPA isolates from four European countries is presented. The CAPA isolates were compared with A. fumigatus from a wider population of 167 non-CAPA clinical isolates and 73 environmental isolates. Bioinformatic analysis and antifungal susceptibility testing were performed to quantify resistance and identify possible genetically-encoded azole-resistant mechanisms. Phylogenetic analysis of the 21 CAPA isolates showed a lack of genetic distinction from the wider A. fumigatus population, with isolates distributed within two distinct clades (A and B), with the majority of the CAPA isolates in clade B (71.4%). The prevalence of phenotypic azole-resistance in CAPA was 14.3% ( n =3/21); all three CAPA isolates contained a known resistance-associated cyp51A polymorphism. CAPA isolates are drawn from the wider A. fumigatus population rather than forming a unique genetic background showing that COVID-19 patients are susceptible to the entire A. fumigatus population. However, the relatively high prevalence of azole-resistance alleles that we document poses a threat to treatment success rates, warranting enhanced detection and surveillance of A. fumigatus genotypes in these patients. Furthermore, potential changes to antifungal first-line treatment guidelines may be needed to improve patient outcomes.

Abstract Background Clostridioides difficile places an increasing burden on healthcare because of emerging hypervirulent strains such as RT078/ST11 that may be resistant to commonly prescribed antibiotics e.g. fluoroquinolones. Pigs are often colonized by RT078/ST11 and act as potential reservoir for human C. difficile infection (CDI). They are the highest consumers of veterinary antimicrobials in many countries.1 We investigated the susceptibility of C. difficile to antibiotics that are commonly prescribed and/or used to treat CDI. Methods Sequenced C. difficile (humans=50, pigs=40), collected as part of a One Health investigation into the epidemiology of pig and human C. difficile, were chosen for phenotypic antimicrobial susceptibility testing (AST). Strains included ST11 (n=70), ST44 (n=9), ST16 (n=6), ST8 (n=5). Susceptibility to a panel of antibiotics were determined using ANAERO3 Sensititre™ plates and Etest®, according to the manufacturer’s instructions. Selected C. difficile ST11 isolates (n=30) were tested for ciprofloxacin and delafloxacin susceptibility using Etest®. Breakpoints were interpreted as per EUCAST, CLSI and Freeman.2C. difficile genomes (n=90) were screened for AMR markers using NCBI AMRFinderPlus. Results Phenotypic testing found all isolates were susceptible to vancomycin and metronidazole, and to penicillin, amoxicillin, amoxiclav, piperacillin/tazobactam, piperacillin, imipenem and chloramphenicol. Resistance was found to cefoxitin (100%), ceftriaxone (100%), erythromycin (48.94%), clindamycin (28.72%), moxifloxacin (48.94%), tetracycline (31.91%) and rifampicin (2.13%). All 30 ST11 isolates were resistant to ciprofloxacin, while the mean MIC for delafloxacin was 0.47 mg/L. There was no difference between resistance rate and C. difficile host. Bioinformatic analysis of 90 C. difficile genomes revealed resistance determinants for quinolones (87%) and tetracyclines (69%). Conclusions No resistance to vancomycin and metronidazole in these C. difficile isolates is reassuring, although larger datasets for surveillance should be investigated. Finding resistance determinants in the isolates in this study demonstrates that WGS is a valuable tool for detecting AMR. Quinolone and tetracycline resistance may be linked with use of these antibiotics on Irish pig farms (64.1% and 85.1% of farms, respectively).1

The continued evolution of SARS-CoV-2 variants capable of subverting vaccine and infection-induced immunity suggests the advantage of a broadly protective vaccine against betacoronaviruses (β-CoVs). Recent studies have isolated monoclonal antibodies (mAbs) from SARS-CoV-2 recovered-vaccinated donors capable of neutralizing many variants of SARS-CoV-2 and other β-CoVs. Many of these mAbs target the conserved S2 stem region of the SARS-CoV-2 spike protein, rather the receptor binding domain contained within S1 primarily targeted by current SARS-CoV-2 vaccines. One of these S2-directed mAbs, CC40.8, has demonstrated protective efficacy in small animal models against SARS-CoV-2 challenge. As the next step in the pre-clinical testing of S2-directed antibodies as a strategy to protect from SARS-CoV-2 infection, we evaluated the

Abstract Alpha-tubulin 4A encoding gene (TUBA4A) has been associated with familial amyotrophic lateral sclerosis (fALS) and fronto-temporal dementia (FTD), based on identification of likely pathogenic variants in patients from distinct ALS and FTD cohorts. By screening a multicentric French cohort of 448 unrelated probands presenting with cerebellar ataxia, we identified ultra-rare TUBA4A missense variants, all being absent from public databases and predicted pathogenic by multiple in-silico tools. In addition, gene burden analyses in the 100,000 genomes project (100KGP) showed enrichment of TUBA4A rare variants in the inherited ataxia group compared to controls (OR: 57.0847 [10.2- 576.7]; p = 4.02 x10-07). Altogether, we report 12 patients presenting with spasticity and/or cerebellar ataxia and harboring a predicted pathogenic TUBA4A missense mutation, including 5 confirmed de novo cases and a mutation previously reported in a large family presenting with spastic ataxia. Cultured fibroblasts from 3 patients harboring distinct TUBA4A missense showed significant alterations in microtubule organisation and dynamics, providing insight of TUBA4A variants pathogenicity. Our data confirm the identification of a hereditary spastic ataxia disease gene with variable age of onset, expanding the clinical spectrum of TUBA4A associated phenotypes.

Abstract Candida tropicalis is a human pathogen that primarily infects the immunocompromised. Whereas the genome of one isolate, C. tropicalis MYA-3404, was originally sequenced in 2009, there have been no large-scale, multi-isolate studies of the genetic and phenotypic diversity of this species. Here, we used whole genome sequencing and phenotyping to characterize 77 isolates C. tropicalis isolates from clinical and environmental sources from a variety of locations. We show that most C. tropicalis isolates are diploids with approximately 2 - 6 heterozygous variants per kilobase. The genomes are relatively stable, with few aneuploidies. However, we identified one highly homozygous isolate and six isolates of C. tropicalis with much higher heterozygosity levels ranging from 36 - 49 heterozygous variants per kilobase. Our analyses show that the heterozygous isolates represent two different hybrid lineages, where the hybrids share one parent (A) with most other C. tropicalis isolates, but the second parent (B or C) differs by at least 4% at the genome level. Four of the sequenced isolates descend from an AB hybridization, and two from an AC hybridization. The hybrids are MTL a / α heterozygotes. Hybridization, or mating, between different parents is therefore common in the evolutionary history of C. tropicalis . The new hybrids were predominantly found in environmental niches, including from soil. Hybridization is therefore unlikely to be associated with virulence. In addition, we used genotype-phenotype correlation and CRISPR-Cas9 editing to identify a genome variant that results in the inability of one isolate to utilize certain branched-chain amino acids as a sole nitrogen source. Author summary Candida tropicalis is an important fungal pathogen, which is particularly common in the Asia-Pacific and Latin America. There is currently very little known about the diversity of genotype and phenotype of C. tropicalis isolates. By carrying out a phylogenomic analysis of 77 isolates, we find that C. tropicalis genomes range from very homozygous to highly heterozygous. We show that the heterozygous isolates are hybrids, most likely formed by mating between different parents. Unlike other Candida species, the hybrids are more common in environmental than in clinical niches, suggesting that for this species, hybridization is not associated with virulence. We also explore the range of phenotypes, and we identify a genomic variant that is required for growth on valine and isoleucine as sole nitrogen sources.