Article9 September 2004free access Rad18 guides polη to replication stalling sites through physical interaction and PCNA monoubiquitination Kenji Watanabe Kenji Watanabe Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Satoshi Tateishi Satoshi Tateishi Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Michio Kawasuji Michio Kawasuji Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Toshiki Tsurimoto Toshiki Tsurimoto Department of Biology, School of Sciences, Kyushu University, Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Hirokazu Inoue Hirokazu Inoue Department of Regulation Biology, Faculty of Science, Saitama University, Urawa, Japan Search for more papers by this author Masaru Yamaizumi Corresponding Author Masaru Yamaizumi Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Kenji Watanabe Kenji Watanabe Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Satoshi Tateishi Satoshi Tateishi Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Michio Kawasuji Michio Kawasuji Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Toshiki Tsurimoto Toshiki Tsurimoto Department of Biology, School of Sciences, Kyushu University, Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Hirokazu Inoue Hirokazu Inoue Department of Regulation Biology, Faculty of Science, Saitama University, Urawa, Japan Search for more papers by this author Masaru Yamaizumi Corresponding Author Masaru Yamaizumi Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kumamoto, Japan Search for more papers by this author Author Information Kenji Watanabe1,2,‡, Satoshi Tateishi1,‡, Michio Kawasuji2, Toshiki Tsurimoto3, Hirokazu Inoue4 and Masaru Yamaizumi 1 1Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kumamoto, Japan 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, Kumamoto, Japan 3Department of Biology, School of Sciences, Kyushu University, Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka, Japan 4Department of Regulation Biology, Faculty of Science, Saitama University, Urawa, Japan ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University, Kuhonji 4-24-1, Kumamoto 862-0976, Japan. Tel.: +81 96 373 6601; Fax: +81 96 373 6604; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2004)23:3886-3896https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600383 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The DNA replication machinery stalls at damaged sites on templates, but normally restarts by switching to a specialized DNA polymerase(s) that carries out translesion DNA synthesis (TLS). In human cells, DNA polymerase η (polη) accumulates at stalling sites as nuclear foci, and is involved in ultraviolet (UV)-induced TLS. Here we show that polη does not form nuclear foci in RAD18−/− cells after UV irradiation. Both Rad18 and Rad6 are required for polη focus formation. In wild-type cells, UV irradiation induces relocalization of Rad18 in the nucleus, thereby stimulating colocalization with proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and Rad18/Rad6-dependent PCNA monoubiquitination. Purified Rad18 and Rad6B monoubiquitinate PCNA in vitro. Rad18 associates with polη constitutively through domains on their C-terminal regions, and this complex accumulates at the foci after UV irradiation. Furthermore, polη interacts preferentially with monoubiquitinated PCNA, but polδ does not. These results suggest that Rad18 is crucial for recruitment of polη to the damaged site through protein–protein interaction and PCNA monoubiquitination. Introduction Exposure of cells to ultraviolet (UV) light causes several types of DNA damage. Among these, cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and 6-4 photoproducts are major DNA lesions. In normal vertebrate cells, 6-4 photoproducts are efficiently repaired by nucleotide-excision repair, but nearly 50% of CPDs remain unrepaired even at 24 h after UV irradiation (Mitchell and Nairn, 1989). In such a situation, the DNA replication machinery often encounters the lesion during the S-phase of the cell cycle, and stalls at the replication fork, resulting in a gap opposite the site of damage in the newly synthesized DNA strand. Cell death may be imminent unless the gap is filled. This gap-filling process is operationally defined as postreplication repair (PRR), which is characterized by restarting of DNA replication without removal of the lesion on a template strand. PRR is observed in diverse species from Escherichia coli to humans. It is hypothesized that PRR is mediated by either translesion DNA synthesis (TLS) or recombination to resolve the stalled replication fork (Broomfield et al, 2001). In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, genes belonging to the RAD6 epistasis group are involved in the PRR pathway, where Rad18 (a putative ubiquitin ligase) and Rad6 (a ubiquitin-conjugating enzyme, E2) play a pivotal role (Bailly et al, 1994, 1997a). rad6 and rad18 mutants are highly susceptible to various DNA-damaging agents including UV and methylmethanesulfonate (MMS) (Hynes and Kunz, 1981). rad6 and rad18 mutants, however, show reduced mutation frequency following treatments with UV and MMS, possibly because error-prone TLS does not work without Rad18/Rad6. Because Rad18 protein binds to single-stranded DNA and forms a tight complex with Rad6 protein (Bailly et al, 1994, 1997b), it is proposed that Rad18 recruits Rad6 protein at replication stalling sites through binding to gap regions, and that the Rad18 complex ubiquitinates some target molecules on the stalled replication forks. Recently, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was shown to be monoubiquitinated in a Rad18/Rad6-dependent manner, which is necessary for tolerance to DNA damage (Hoege et al, 2002; Stelter and Ulrich, 2003). Interaction with PCNA is essential for the function of Rad30 (Haracska et al, 2001a), a yeast homolog of polymerase η, which is a member of RAD6 epistasis group (McDonald et al, 1997). These results suggest that PCNA might be a major target of Rad18/Rad6 in the PRR process. In vertebrate cells, thus far only a single homolog of RAD18 has been identified (Tateishi et al, 2000). Human and mouse Rad18 interacts with two forms of the Rad6 homolog, Rad6A and Rad6B, both in vitro and in vivo (Tateishi et al, 2000, 2003; Xin et al, 2000). RAD18 knockout mouse embryonic stem (ES) cells and chicken DT40 cells manifest sensitivity to various DNA-damaging agents and enhanced genomic instability as determined by increased sister-chromatid exchange (SCE) and frequency of stable transformation (Yamashita et al, 2002; Tateishi et al, 2003). Vertebrate polymerase η (polη), a homolog of the RAD30 gene product of the yeast, is a member of a recently discovered Y-family of novel DNA polymerases including polι and polκ (Burgers et al, 2001; Ohmori et al, 2001). They are shown to be involved in TLS in vitro, and structurally related to each other, but unrelated to the replicative polymerases (polδ and polε). Polη has a highly distributive, rather than processive, mode of DNA synthesis on undamaged templates and a relatively low stringency (Johnson et al, 2000; Matsuda et al, 2000). However, polη can insert correct nucleotides opposite CPDs in TLS (Johnson et al, 1999; McCulloch et al, 2004). The gene encoding polη is mutated in a cancer-prone hereditary disorder, xeroderma pigmentosum variant (XPV) (Masutani et al, 1999). It is possible that without normal polη CPD becomes highly mutagenic probably due to TLS by some other error-prone polymerase(s), resulting in skin cancers of sun-exposed areas. When the replicative machinery encounters unrepaired CPD lesions, it is expected that the replicative polymerase is switched to polη to carry out TLS in normal cells. In UV-irradiated human cells, polη forms discrete nuclear foci in a UV-dose- and time-dependent manner (Kannouche et al, 2001). The sites of these foci are colocalized with PCNA, suggesting that these are sites of stalled replication. Because a polη deletion mutant, which has a polymerase activity but does not show focus formation following UV irradiation, cannot complement the sensitivity of XPV cells to UV irradiation, foci formation is an essential step of polη function. However, molecular mechanisms of how polη forms nuclear foci in UV-irradiated cells are largely unknown. In the study reported here, in order to understand the role of Rad18 in tolerance to UV-induced DNA damage, we used RAD18−/− mouse fibroblasts from RAD18 knockout mice to show that Rad18 functions as an essential coordinator of the formation of polη foci through PCNA monoubiquitination and physical interaction with polη. Results Requirement of Rad18 for PCNA monoubiquitination To investigate the role of Rad18 in UV-induced TLS, we established cell lines from RAD18 knockout mice (Tateishi et al, 2003). These cells did not express detectable levels of Rad18 protein, but showed normal levels of Rad6A/B (Figure 1A) and normal growth rates (Figure 1B). In wild-type (WT) cells, a band of PCNA corresponding to 44 kDa increased in a UV dose- and time-dependent manner, while in RAD18−/− cells, the band remained at the control level up to 8 h after UV irradiation even at 40 J/m2 (Figure 1C and D). Similar modification of PCNA in MMS-treated HeLa cells was reported (Hoege et al, 2002). We concluded that this band represented a monoubiquitinated form of PCNA for two reasons. (i) Unmodified PCNA was detected at 36 kDa in SDS–PAGE (Figure 1C–E) and, when lysates of UV-irradiated cells expressing transfected HA-tagged ubiquitin were immunoprecipitated, bands of 45 and 44 kDa were detected by immunoblotting with an anti-HA antibody and anti-PCNA antibody, respectively (Figure 1E, lanes 2 and 3). (ii) Unmodified PCNA was converted to a 44 kDa band of monoubiquitinated PCNA in vitro by purified Rad18 and Rad6B of human origin plus ubiquitin (Figure 1E, lanes 7, 11, and 12). When ubiquitin was replaced with FLAG-tagged ubiquitin in this system, a 45 kDa band appeared (Figure 1E, lane 13). These results indicate that Rad18 is a ubiquitin ligase for the monoubiquitination of PCNA. Figure 1.Rad18 dependent monoubiquitination of PCNA by Rad18 and Rad6A/B in vivo and in vitro. (A) Western blot of Rad18 and Rad6A/B in RAD18−/− cells. α-Tubulin was included as a control. An asterisk shows nonspecific bands. (B) Growth curves of RAD18−/− cells. (C, D) Monoubiquitination of PCNA as determined by Western blot. Cells were harvested 5 h later following various doses of UV irradiation (C). In (D), cells were irradiated at 30 J/m2 and harvested at the indicated times. (E) In vivo (left, lanes 1–6) and in vitro (right, lanes 7–13) monoubiquitination of PCNA. GM637 cells were transfected with HA-ubiquitin (lanes 1–4) and irradiated with UV (13 J/m2, 6 h). Lysates were immunoprecipitated and blotted as indicated. In lanes 5 and 6, GM637 cells without transfection were irradiated at 0 and 13 J/m2 (6 h), respectively. Lane 7 represents an in vitro ubiquitination product. In lane 12, two-fold amounts of E2 and E3 were included in the reaction. Download figure Download PowerPoint In budding yeast, Rad18 binds to Rad6 through its Rad6-binding domain (R6BD) (Bailly et al, 1997b). This domain is highly conserved among various species. To confirm that the putative R6BD in hRad18 (amino-acid residues 340–395; Figure 2A) was a binding site for Rad6A/B, we transfected a Rad18 plasmid lacking R6BD together with a Rad6A/B plasmid into COS-7 cells, and performed co-immunoprecipitation experiments. Rad18 protein lacking R6BD localized in the nuclei like WT Rad18 (data not shown), but did not interact with human Rad6A/B (Figure 2A, lanes 1, 2, 5, and 6). To confirm whether the failure of PCNA ubiquitination in RAD18−/− cells was really due to a defect in Rad18, we established multiple RAD18−/− cell clones stably expressing WT human Rad18 (hRad18) (Figure 2B). PCNA ubiquitination following UV irradiation was restored to the WT level, whereas control RAD18−/− cells transfected with an empty vector did not show such recovery (Figure 2B). To examine whether PCNA ubiquitination required Rad6A/B together with Rad18, we established RAD18−/− cells stably expressing Rad18 but lacking R6BD (hRad18DR6). In these cells, PCNA was not ubiquitinated after DNA damage (Figure 2B). Furthermore, to confirm the requirement of Rad6A/B for PCNA monoubiquitination directly, Rad6 siRNA corresponding to both Rad6A and Rad6B was transfected into human cells, and reduced levels of Rad6A/B protein levels were confirmed by Western blot. In these cells, PCNA monoubiquitination was substantially reduced (Figure 2C). These results clearly indicate that in UV-irradiated mammalian cells, PCNA is monoubiquitinated in a Rad18- and Rad6A/B-dependent manner. To evaluate the significance of the monoubiquitination activity of Rad18, we determined the UV sensitivity of RAD18−/− mouse cells stably expressing hRad18. These cells showed almost normal UV sensitivity, while stable transformants with hRad18 lacking R6BD, or with the vector alone, remained sensitive to UV at the parent cell levels (Figure 2D). These results suggest that the UV sensitivity of RAD18−/− cells is caused at least in part by defects in the monoubiquitination of PCNA and subsequent foci formation of polη. Figure 2.Requirement of Rad6A/B for monoubiquitination of PCNA in UV-irradiated cells. (A) Interaction of WT and mutant hRad18 with hRad6A/B. Full-length and mutant Rad18 proteins are schematically shown on the top panel. Plasmids were transfected into COS-7 cells with different combinations indicated on the left of the middle panels, and immunoprecipitation was performed. Similar levels of expression of hRad18 and hRad6A/B proteins in the transformed cells were confirmed in the lower panel. (B) Restoration of PCNA monoubiquitination in RAD18−/− cells by expression of WT hRad18 but not of mutant hRad18. Cells were incubated for 6 h following UV irradiation at 20 J/m2. Cell lysates were immunoprecipitated and blotted with an anti-PCNA antibody (upper panel). Expression of FLAG-hRad18 or FLAG-Rad18DR6 was confirmed in individual clones of stable transformants of RAD18−/− mouse fibroblasts by Western blot with an anti-Rad18 rabbit antibody (lower panel). α-Tubulin was indicated as a volume control. (C) Inhibition of PCNA monoubiquitination by siRNA for Rad6A/B. WI38VA13 cells were transfected with Rad6A and Rad6B siRNA, incubated for 4 days, and then irradiated with 10 J/m2 of UV light. At the indicated times, protein levels of monoubiquitinated PCNA were determined by Western blot. An asterisk shows a nonspecific band that remained constant following the siRNA treatment. (D) Restoration of UV sensitivity of RAD18−/− mouse cells by introduction of human Rad18 as determined by a colony-forming assay. Two independent clones of stable transformants (WT#1 and WT#2 in (B)) were tested. Download figure Download PowerPoint Relocalization of Rad18 at stalling sites with PCNA In mammalian cells fixed with formaldehyde, a substantial fraction of Rad18 was homogeneously localized in the nucleus, while the remaining fraction existed as dots of irregular shapes and sizes (Figure 3A, left). Notably, most of the nuclear dots of Rad18 dispersed throughout the nucleus within 15 min with UV doses as low as 5 J/m2 (Figure 3A, middle). Rad18 dispersion occurred in the presence of cycloheximide (data not shown), suggesting that direct or indirect post-translational modification of Rad18 is involved in this process. Within a few hours after UV irradiation, nuclear foci of Rad18 with uniform sizes appeared (Figure 3A, right). Such dynamic intranuclear translocation of Rad18 was much more clearly detected in cells fixed with methanol (Figure 3B). To investigate the relationship between Rad18 and PCNA, we performed double immunostaining on methanol-fixed cells. Under normal conditions, partial colocalization of Rad18 with PCNA was observed (Figure 3B, upper). Within 1 h after UV irradiation, almost all of Rad18 became colocalized with PCNA (Figure 3B, lower) and such colocalization was observed at least up to 4 h, suggesting that Rad18 translocates to the replication stalling sites. To confirm directly this assumption, UV-irradiated cells were labeled with BrdU and stained for Rad18 and incorporated BrdU. Before UV irradiation, BrdU sites were partially colocalized with Rad18 (Figure 3C, upper), but after UV irradiation most of the BrdU sites were colocalized with translocated Rad18 (Figure 3C, lower). Since colocalization of Rad18 with PCNA was observed in XPV cells with a similar time course, it was inferred that translocation of Rad18 does not require functional polη (data not shown). To determine the subnuclear localization of PCNA, chromatin fractions were separated from UV-irradiated cells. Almost equal amounts of unmodified PCNA were obtained in the soluble and chromatin fractions irrespective of UV irradiation. In contrast, monoubiquitinated PCNA was exclusively recovered in the chromatin fraction of UV-irradiated cells, and it moved to the solubilized nuclear fraction after treatment with micrococcal nuclease (Figure 3D), suggesting that monoubiquitinated PCNA is tightly associated with chromatin. We could not detect any apparent physical interaction between Rad18 and PCNA before or after UV irradiation by co-immunoprecipitation, suggesting that the interaction is weak or transient (data not shown). Figure 3.Colocalization of Rad18 with PCNA on chromatin following UV irradiation. (A) Dispersion and relocalization of Rad18. GM637 cells irradiated at 15 J/m2 were fixed with formaldehyde and stained for Rad18. Bar=20 μm. (B) UV-induced colocalization of Rad18 with PCNA. GM637 cells irradiated at 15 J/m2 were fixed with methanol 4 h after UV irradiation and processed for double staining for Rad18 (green) and PCNA (red). Bar=10 μm. (C) Accumulation of Rad18 at the replication stalling sites. UV-irradiated (15 J/m2) GM637 cells were labeled for 2 h with BrdU, fixed with methanol, and processed for double staining for Rad18 (red) and BrdU (green). Bar=10 μm. (D) Binding of monoubiquitinated PCNA to chromatin. Chromatin fractions were isolated from UV-irradiated (15 J/m2, 6 h) or nonirradiated HeLa cells, and then treated with micrococcal nuclease (MNase). The distributions of PCNA in the total cell lysate (TCL), soluble fraction (S2), solubilized nuclear fraction (S3), and chromatin-enriched fraction (P3) are shown. Orc2 is shown as a chromatin fraction marker. Download figure Download PowerPoint Requirement of Rad18 for polη focus formation Using polη fused to enhanced green fluorescent protein (eGFP-polη), Kannouche et al (2001) found that polη, which localizes uniformly in the nucleus under normal conditions, formed distinct nuclear foci at the replication stalling sites after treatment with DNA-damaging agents including UV and MMS. This polη focus formation is essential for UV survival, because mutant polη, which is defective in focus formation, could not complement UV survival of XPV cells (Kannouche et al, 2001). To investigate whether Rad18 is required for polη focus formation, we introduced eGFP-hpolη into either RAD18−/− or RAD18+/+ mouse cells. While polη focus formation was clearly observed in the UV-irradiated WT cells, polη remained uniformly dispersed in the nucleus of UV-irradiated RAD18−/− cells (Figure 4A). The formation of polη foci proceeded gradually and reached a plateau at 6 h after UV irradiation at least with dosages ranging 10–20 J/m2 (Figure 4B). Defective focus formation in RAD18−/− cells could be restored by concomitant introduction of WT hRad18 with or without a FLAG tag in its N-terminal region (Figure 4A and C, data not shown). However, hRad18 lacking R6BD did not restore the focus formation (Figure 4C). Furthermore, the formation of polη foci was significantly inhibited in cells treated with Rad6A/B siRNA (Figure 4D). These results indicate that UV-induced polη focus formation is dependent on both Rad18 and Rad6A/B. Figure 4.Rad18- and Rad6-dependent formation of polη foci. (A) Focus formation of eGFP-polη following UV irradiation in WT cells but not in RAD18−/− cells. Cells were irradiated at 15 J/m2. After 6 h, the distribution of eGFP-polη was examined after fixation. Defective focus formation of polη was recovered by concomitant expression of Rad18. Bar=10 μm. (B) Time course of eGFP-polη focus formation in UV-irradiated cells. RAD18−/− mouse cells and WT cells were transfected with eGFP-polη. After 20 h, cells were irradiated with UV at the indicated doses. (C) Restoration of eGFP-polη focus formation in UV-irradiated (20 J/m2) RAD18−/− cells by expression of WT hRad18 but not of mutant hRad18 lacking the Rad6-binding domain. (D) Inhibition of polη focus formation by siRNA for Rad6. WI38VA13 cells were transfected with Rad6A and Rad6B siRNA, cultured for 3 days, and then transfected again with an eGFP-polη plasmid. After 20 h, cells were irradiated with UV (10 J/m2), and 6 h later cells containing eGFP-polη foci were counted. Download figure Download PowerPoint Association of Rad18 with polη Immunostaining for Rad18 clearly demonstrated that Rad18 colocalized with eGFP-polη at the foci following UV irradiation (Figure 5A, lower). To investigate the interaction between Rad18 and polη, HA-tagged polη was transfected into GM637 cells, and co-immunoprecipitation experiments were performed. Rad18 was consistently associated with polη, irrespective of UV irradiation (Figure 5B). Furthermore, purified polη bound to purified Rad18 in an immunoprecipitation assay, but polδ did not (Figure 5C, lanes 2 and 4), indicating that at least a part of Rad18 is directly associated with polη in a UV-independent manner. To determine the binding site of polη to Rad18, we overexpressed a series of deletion mutants of polη fused with GST at their N-terminal regions (Figure 6A) in insect cells, and purified them with glutathione beads (Figure 6B). GM637 cell lysates were pulled down with these beads. Rad18 interacted with full-length polη and a C-terminal fragment of polη (GST-polη158c) spanning amino-acid residues 556–713 (Figure 6C). We also determined the binding site of Rad18 to polη in a similar way. In this assay, Myc-tagged WT and deleted Rad18 proteins were overexpressed in COS-7 cells (Figure 6D and E), and cell lysates were pulled down with glutathione beads associated with GST-polη158c. Among the deletion mutants, only Rad18 lacking a region spanning amino-acid residues 402–444 could not interact with polη (Figure 6F). To evaluate the biological significance of the interaction between Rad18 and polη, hRad18 lacking the polη-binding domain (hRad18DC2) was transiently expressed in RAD18−/− mouse cells together with eGFP-polη. Formation of eGFP-polη foci was not restored following UV irradiation (Supplementary Figure S1). Furthermore, RAD18−/− cells stably expressing Rad18 lacking the polη-binding domain showed high UV sensitivity like cells transformed with an empty vector (Supplementary Figures S2 and S3), while they had normal levels of monoubiquitination of PCNA after UV irradiation. These results suggest that Rad18 recruits polη to replication stalling sites through direct interaction. Since eGFP-polη localized uniformly in the nucleus with Rad18 under normal conditions (Figure 5A), the nuclear dots of Rad18 in nonirradiated cells might be reservoirs of free Rad18. Figure 5.Direct interaction of polη with Rad18. (A) UV-induced colocalization of Rad18 with eGFP-polη in GM637 cells. Cells transfected with eGFP-polη and FLAG-Rad18 plasmids were irradiated at 15 J/m2 and incubated for 6 h. After fixation, cells were stained for Rad18 with an antibody against FLAG. Bar=10 μm. (B) Interaction of Rad18 with polη. HA-polη was transiently expressed in GM637 cells. Immunoprecipitation was performed at various times after UV irradiation (12.5 J/m2). As a control, UV-irradiated cell lysates (6 h) were immunoprecipitated with control IgG. (C) Direct binding of Rad18 with polη. Recombinant Rad18 and polη were purified from insect cells. After incubation of the mixture, Rad18 was immunoprecipitated and polη bound to Rad18 was detected by Western blot. Polδ was used as a control. Download figure Download PowerPoint Figure 6.Determination of binding sites. (A) Structural domains of GST-polη fusion proteins. P: putative PCNA-binding domain; Z: zinc-finger domain. (B) Purification of GST- polη fusion proteins by glutathione beads. Proteins bound to the beads were stained with Coomassie brilliant blue (CBB, arrowheads). (C) Pull-down assay. GM637 cell lysates were pulled down with GST-polη fusion proteins bound to glutathione beads. Interaction with Rad18 was analyzed by Western blot. (D) Structural domains of Myc-tagged Rad18 proteins. R: RING finger domain; Z: zinc-finger domain. (E) Deletion mutant proteins were overexpressed in COS-7 cells and their expression was confirmed by Western blot. (F) COS-7 cell lysates containing Myc-tagged mutant Rad18 proteins were pulled down with GST-polη158c bound to glutathione beads. Association of WT and mutant Rad18 proteins with polη was analyzed by Western blot using an anti-Myc antibody. Download figure Download PowerPoint Preferential binding of polη to monoubiquitinated PCNA To investigate the molecular mechanism of how UV-induced monoubiquitination of PCNA functions in polymerase switching to polη, the physical interaction between PCNA and polη was determined by a pull-down assay. GST-polη bound to glutathione beads was mixed with lysates prepared from UV-irradiated HeLa cells, and PCNA associated with the GST-polη beads was revealed by Western blot. While monoubiquitinated PCNA was a minor fraction of the total PCNA in the lysates, it was recovered predominantly from the precipitated beads in a time-dependent manner (Figure 7A, right). In contrast, monoubiquitinated PCNA was not associated with GST-polδ in the same assay (Figure 7A, middle). The affinity of monoubiquitinated PCNA for polη was much higher than that of unmodified PCNA, because even at higher salt concentrations, monoubiquitinated PCNA remained bound to polη (Figure 7B, left). Monoubiquitinated PCNA bound to polη was much more refractory to elution by high salt concentrations than unmodified PCNA (Figure 7B, right). To investigate whether polη interacted with monoubiquitinated PCNA in UV-irradiated cells, HA-polη was transiently expressed in GM637 cells, and co-immunoprecipitation assay was performed. In this experiment, cells were treated with 0.1% NP-40 before preparation of cell lysates. This treatment allowed specific crosslinking between chromatin-bound polη and monoubiquitinated PCNA probably by excluding unmodified PCNA and a diffused form of polη from nuclei. Monoubiquitinated PCNA was preferentially immunoprecipitated with HA-polη in the UV-irradiated cells (Figure 7C, lanes 5 and 6). In contrast, monoubiquitinated PCNA was not immunoprecipitated in nonirradiated cells (Figure 7C, lanes 2 and 3). Taken together, these results indicate that polη preferentially binds to monoubiquitinated PCNA both in vitro and in vivo. To prove that the interaction between polη and monoubiquitinated PCNA is direct, PCNA was monoubiquitinated in the in vitro PCNA ubiquitination reaction (Figure 1E). Rad18 and Rad6B were then removed from the in vitro PCNA ubiquitination reaction mixture (Figure 1E) by multiple cycles of immunodepletion with an anti-Rad18 antibody (Figure 7D, upper). Immunodepletion of Rad18 and Rad6B was confirmed by Western blot. Monoubiquitinated PCNA still bound to polη in a pull-down assay (Figure 7D, lane 3). In contrast, polη lacking the three putative PCNA-binding sites on the C-terminus (Kannouche et al, 2001) showed no interaction with PCNA (Figure 7D, lane 2). Immunostaining demonstrated that more than 50% of the transfected eGFP-polη colocalized with endogenous polδ 5 h after UV irradiation (Figure 7E). Furthermore, endogenous polδ colocalized with PCNA in UV-irradiated cells (Figure 7F), suggesting that both polymerases and Rad18 localize at the same stalling sites. Figure 7.Preferential binding of polη to monoubiquitinated PCNA. (A) Binding of polη to ubiquitinated PCNA. HeLa cells were irradiated with UV at 20 J/m2. PCNA in the cell lysates was pulled down with either GST-polη beads or polδ beads, and analyzed by Western blot using an anti-PCNA antibody. (B) Effects of different salt concentrations on the binding of PCNA to GST-polη (left) and on PCNA elution from GST-polη (right). PCNA pulled down was washed with buffer containing various concentrations of NaCl. PCNA in bound or eluted fractions was analy

Eukaryotic DNA polymerase delta and its accessory proteins are essential for SV40 DNA replication in vitro. A multi-subunit protein complex, replication factor C (RF-C), which is composed of subunits with apparent molecular weights of 140,000, 41,000, and 37,000, has primer/template binding and DNA-dependent ATPase activities. UV-cross-linking experiments demonstrated that the Mr = 140,000 subunit recognizes and binds to the primer-template DNA, whereas the Mr = 41,000 polypeptide binds ATP. Assembly of a replication complex at a primer-template junction has been studied in detail with synthetic, hairpin DNAs. Following glutaraldehyde fixation, a gel shift assay demonstrated that RF-C alone forms a weak binding complex with the hairpin DNA. Addition of ATP or its nonhydrolyzable analogue, ATP gamma S, increased specific binding to the DNA. Footprinting experiments revealed that RF-C recognizes the primer-template junction, covering 15 bases of the primer DNA from the 3'-end and 20 bases of the template DNA. Another replication factor, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) binds to RF-C and the primer-template DNA forming a primer recognition complex and extends the protected region on the duplex DNA. This RF-C.PCNA complex has significant single-stranded DNA binding activity in addition to binding to a primer-template junction. However, addition of another replication factor, RF-A, completely blocked the nonspecific, single-stranded DNA binding by the RF-C.PCNA complex. RF-A therefore functions as a specificity factor for primer recognition. In the absence of RF-C, DNA polymerase delta (pol delta) and PCNA form a complex at the primer-template junction, protecting exactly the same site as the primer recognition complex. Addition of RF-C to this complex produced a higher order complex which is unstable unless its formation is coupled with translocation of pol delta. These results suggest that the sequential binding of RF-C, PCNA, and pol delta to a primer-template junction might directly account for the initiation of leading strand DNA synthesis at a replication origin. We demonstrate this directly in an accompanying paper (Tsurimoto, T., and Stillman, B. (1991) J. Biol. Chem. 266, 1961-1968).

Article16 February 2006free access Two E3 ubiquitin ligases, SCF-Skp2 and DDB1-Cul4, target human Cdt1 for proteolysis Hideo Nishitani Corresponding Author Hideo Nishitani Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Nozomi Sugimoto Nozomi Sugimoto Virology Division, National Cancer Center Research Institute, Chuoh-ku, Tokyo, Japan Search for more papers by this author Vassilis Roukos Vassilis Roukos Laboratory of General Biology, School of Medicine, University of Patras, Rio, Patras, Greece Search for more papers by this author Yohsuke Nakanishi Yohsuke Nakanishi Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Masafumi Saijo Masafumi Saijo Graduate School of FrontierBioscience, Osaka University, Japan Search for more papers by this author Chikashi Obuse Chikashi Obuse Department of Gene Mechanisms, Graduate School of Biostudies, Kyoto University, Yoshida-Honmachi, Sakyo-ku, Kyoto, Japan Search for more papers by this author Toshiki Tsurimoto Toshiki Tsurimoto Department of Biology, School of Sciences, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Keiichi I Nakayama Keiichi I Nakayama Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Keiko Nakayama Keiko Nakayama Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Masatoshi Fujita Masatoshi Fujita Virology Division, National Cancer Center Research Institute, Chuoh-ku, Tokyo, Japan Search for more papers by this author Zoi Lygerou Zoi Lygerou Laboratory of General Biology, School of Medicine, University of Patras, Rio, Patras, Greece Search for more papers by this author Takeharu Nishimoto Takeharu Nishimoto Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Hideo Nishitani Corresponding Author Hideo Nishitani Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Nozomi Sugimoto Nozomi Sugimoto Virology Division, National Cancer Center Research Institute, Chuoh-ku, Tokyo, Japan Search for more papers by this author Vassilis Roukos Vassilis Roukos Laboratory of General Biology, School of Medicine, University of Patras, Rio, Patras, Greece Search for more papers by this author Yohsuke Nakanishi Yohsuke Nakanishi Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Masafumi Saijo Masafumi Saijo Graduate School of FrontierBioscience, Osaka University, Japan Search for more papers by this author Chikashi Obuse Chikashi Obuse Department of Gene Mechanisms, Graduate School of Biostudies, Kyoto University, Yoshida-Honmachi, Sakyo-ku, Kyoto, Japan Search for more papers by this author Toshiki Tsurimoto Toshiki Tsurimoto Department of Biology, School of Sciences, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Keiichi I Nakayama Keiichi I Nakayama Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Keiko Nakayama Keiko Nakayama Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Masatoshi Fujita Masatoshi Fujita Virology Division, National Cancer Center Research Institute, Chuoh-ku, Tokyo, Japan Search for more papers by this author Zoi Lygerou Zoi Lygerou Laboratory of General Biology, School of Medicine, University of Patras, Rio, Patras, Greece Search for more papers by this author Takeharu Nishimoto Takeharu Nishimoto Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan Search for more papers by this author Author Information Hideo Nishitani 1, Nozomi Sugimoto2, Vassilis Roukos3, Yohsuke Nakanishi1, Masafumi Saijo4, Chikashi Obuse5, Toshiki Tsurimoto6, Keiichi I Nakayama7, Keiko Nakayama7, Masatoshi Fujita2, Zoi Lygerou3 and Takeharu Nishimoto1 1Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan 2Virology Division, National Cancer Center Research Institute, Chuoh-ku, Tokyo, Japan 3Laboratory of General Biology, School of Medicine, University of Patras, Rio, Patras, Greece 4Graduate School of FrontierBioscience, Osaka University, Japan 5Department of Gene Mechanisms, Graduate School of Biostudies, Kyoto University, Yoshida-Honmachi, Sakyo-ku, Kyoto, Japan 6Department of Biology, School of Sciences, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan 7Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Higashi-ku, Fukuoka, Japan *Corresponding author. Department of Molecular Biology, Graduate School of Medical Science, Kyushu University, Maidashi 3-1-1, Higashi-ku, Fukuoka 812-8582, Japan. Tel.: +81 92 642 6177; Fax: +81 92 642 6183; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2006)25:1126-1136https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601002 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Replication licensing is carefully regulated to restrict replication to once in a cell cycle. In higher eukaryotes, regulation of the licensing factor Cdt1 by proteolysis and Geminin is essential to prevent re-replication. We show here that the N-terminal 100 amino acids of human Cdt1 are recognized for proteolysis by two distinct E3 ubiquitin ligases during S–G2 phases. Six highly conserved amino acids within the 10 first amino acids of Cdt1 are essential for DDB1-Cul4-mediated proteolysis. This region is also involved in proteolysis following DNA damage. The second E3 is SCF-Skp2, which recognizes the Cy-motif-mediated Cyclin E/A-cyclin-dependent kinase-phosphorylated region. Consistently, in HeLa cells cosilenced of Skp2 and Cul4, Cdt1 remained stable in S–G2 phases. The Cul4-containing E3 is active during ongoing replication, while SCF-Skp2 operates both in S and G2 phases. PCNA binds to Cdt1 through the six conserved N-terminal amino acids. PCNA is essential for Cul4- but not Skp2-directed degradation during DNA replication and following ultraviolet-irradiation. Our data unravel multiple distinct pathways regulating Cdt1 to block re-replication. Introduction Initiation of cell cycle events is controlled by the sequential activation and inactivation of Cyclin-dependent kinases (CDKs) (Nurse, 1994; Sherr, 1994). S-Cyclin/CDKs are required to initiate DNA replication, while M-Cyclin/CDKs are activated following completion of DNA replication to initiate mitosis. To ensure accurate transmission of the genetic information, it is essential that during each cell cycle no DNA segment is left unreplicated nor does it re-replicate before chromosome segregation occurs. The DNA replication licensing system regulates initiation of DNA replication and inhibition of re-replication by controlling the assembly of the pre-replicative complex (pre-RC) on origins of replication (Blow and Hodgson, 2002; Nishitani and Lygerou, 2004). The pre-RC is formed at the end of mitosis and in G1 phase in a stepwise process: association of Cdc6 and Cdt1 onto the origin recognition complex-bound origins leads to recruitment and loading of the hexameric MCM2–7 complex, which licenses origins for replication (Bell and Dutta, 2002; Blow and Dutta, 2005). Licensing is established in mammalian cells several hours before CDKs and the Dbf4-dependent kinase are activated to initiate replication. The MCM2–7 complex most likely acts as a replicative helicase, leaving the origin, and traveling ahead of the replication machinery (Aparicio et al, 1997; Ishimi, 1997; Labib and Diffley, 2001). Following firing, origins convert to the post-replicative state, and are not licensed again until the completion of cell division. CDKs, while necessary for initiation, inhibit pre-RC formation during S to G2/M by inactivating licensing factors through phosphorylation or direct association (Nguyen et al, 2001; Wuarin et al, 2002). For example, phosphorylation of licensing factors has been shown to lead to their degradation or nuclear exclusion (Drury et al, 1997; Jallepalli et al, 1997; Labib et al, 1999). In higher eukaryotes, Geminin, a specific inhibitor of Cdt1, accumulates from S phase. It binds to Cdt1 and inhibits MCM loading (McGarry and Kirschner, 1998; Wohlschlegel et al, 2000; Tada et al, 2001). Geminin and Cyclin B have a destruction box, and are degraded by the anaphase-promoting complex around anaphase of mitosis. Thus, origin licensing is restricted to the end of mitosis and G1 phase, when CDK activity is low and Geminin is absent (Diffley, 2004). Control of the MCM2–7 loading factors, Cdc6 and Cdt1, is critical to prevent re-replication. High expression of Cdc18, the Schizosaccharomyces pombe Cdc6 homolog, induces massive over-replication in S. pombe, which is promoted by coexpression of Cdt1 (Nishitani and Nurse, 1995; Nishitani et al, 2000). In metazoans, regulation of Cdt1 is believed to be the major means through which re-replication is inhibited. High expression of Cdt1 in mammalian cells and Drosophila or addition of Cdt1 protein to G2 nuclei in Xenopus egg extracts induces re-replication (Vaziri et al, 2003; Thomer et al, 2004; Arias and Walter, 2005; Li and Blow, 2005; Maiorano et al, 2005; Yoshida et al, 2005). It was also shown that silencing of Geminin in human cells leads to re-replication (Melixetian et al, 2004; Zhu et al, 2004). Proteolytic control ensures that human Cdt1 is present only from late mitosis and in G1 phase. Its degradation is promoted by ubiquitination in S phase independently of Geminin binding (Wohlschlegel et al, 2000; Nishitani et al, 2001, 2004; Xouri et al, 2004; Arias and Walter, 2005). Although SCF-Skp2 has been implicated in Cdt1 degradation, evidence against an involvement of SCF-Skp2 has also been reported. Cdt1 binds to and is phosphorylated by Cyclin E/CDK2 and Cyclin A/CDK2, which marks it for recognition by an Skp2-containing E3 ubiquitin ligase (Li et al, 2003; Liu et al, 2004; Nishitani et al, 2004; Sugimoto et al, 2004). However, a recent report showed that a mutant in the Cy-motif of Cdt1, which is refractory to Cyclin/CDK phosphorylation and Skp2 binding, is still degraded in S phase (Takeda et al, 2005). It was also noticed that Cdt1 does not accumulate in Skp2−/− mouse embryonic fibroblasts (MEFs) (Nakayama et al, 2004). On the other hand, Cdt1 is degraded by a Cul4 complex in Caenorhabditis elegans (Zhong et al, 2003) and proteolytic control of Cdt1 is crucial in this organism to block re-replication, since inactivation of Cul4 brings about massive re-replication. In addition, DNA damage such as ultraviolet (UV) radiation induces Cdt1 degradation through Cul4-mediated proteolysis in mammalian cells (Higa et al, 2003; Hu et al, 2004). However, Skp2-dependent Cdt1 degradation following UV-irradiation has also been reported (Kondo et al, 2004). To clarify the proteolytic control of Cdt1 during the cell cycle and following DNA damage in human cells, we performed a detailed domain analysis of human Cdt1. We found that Cdt1 is targeted for ubiquitination by two distinct E3 ubiquitin ligases, which are triggered to target Cdt1 through different pathways and recognize different parts of the N-terminal region of Cdt1. Results Cdt1 is degraded in the absence of Skp2 both after UV-irradiation and in S–G2 phase Cdt1 is degraded promptly after the onset of S phase and upon DNA damage such as UV-irradiation (Wohlschlegel et al, 2000; Nishitani et al, 2001; Higa et al, 2003). To search for proteins involved in Cdt1 degradation, we analyzed proteins copurifying with Cdt1 from HeLa cells treated with the proteasome inhibitor MG132, and recovered Cyclin A and Skp2 (data not shown). We therefore wished to examine whether Skp2 is required for correct cell cycle proteolysis of Cdt1. In order to assess the cell cycle expression profile of Cdt1 in asynchronous populations, we employed double Immunofluorescence (IF) analysis for Cdt1 and Cyclin A. Our assay is based on the observation that in a normal cell cycle, Cdt1 is present exclusively in G1 cells, while Cyclin A is present from S phase to early M phase (Pines and Hunter, 1990; Nishitani et al, 2001). Thus, Cdt1-positive cells are not stained with Cyclin A and vice versa (Figure 1A, upper panel). Perturbations in cell cycle regulation of Cdt1 can therefore be directly assessed at the single-cell level in asynchronous populations by the appearance of Cdt1-Cyclin A double-positive cells. Following UV-irradiation, Cdt1 is undetectable in both Cyclin A-positive and -negative cells (Figure 1A, lower panel; UV). This sensitive assay allows quantitative assessment of the cell cycle degradation of Cdt1 and avoids the use of drugs for synchronization, which could themselves affect Cdt1 proteolysis. Figure 1.Cdt1 degradation in S–G2 phases and after UV-irradiation occurs in the absence of Skp2. (A) Double immunofluorescence analysis of HeLa cells with anti-Cyclin A and anti-Cdt1 antibodies. HeLa cells growing asynchronously (upper panel), or treated with UV (20 J/m2, lower panel; UV) and then returned to culture for 1 h, were fixed and stained with the antibodies indicated. (B) Cdt1 is degraded in the absence of Skp2 in HeLa cells. Cells were transfected with siRNA for Skp2 or luciferase (Luc). At 48 h following transfection, half of the treated cells were irradiated with UV (20 J/m2). After 1 h, cells were fixed for immunofluorescence as above or extracts prepared for immunoblotting with the indicated antibodies. The band marked with an asterisk on the p27 blot is a crossreacting band, which serves as a loading control. (C) Cdt1 degradation in Skp2−/− MEFs. (a) Cell extracts were prepared from Skp2+/+ and −/− MEFs and blotted with anti-Cdt1 and anti-p27 antibodies. RCC1 served as a loading control. (b) Asynchronous cultures of Skp2 +/+ and −/− MEFs were UV-irradiated as indicated, collected at the indicated times (in h), and Cdt1 and p27 protein levels analyzed. Total protein (CBB) served as a loading control. Download figure Download PowerPoint To investigate if Cdt1 is proteolysed in the absence of Skp2, HeLa cells were transfected with siRNA specific for Skp2 (Figure 1B). Western blotting (WB) for Skp2 and p27, a known target of Skp2, demonstrated the efficiency of the RNAi treatment. IF analysis showed that Skp2 protein was undetectable in a large proportion of siSkp2-treated cells (Supplementary Figure S1A). Cell cycle progression was not blocked due to accumulation of p27 in siSkp2-treated cells, as the percentage of BrdU-positive cells was similar in siSkp2 and control-treated cells (Supplementary Figure S1A). Total Cdt1 protein levels increased three-fold in Skp2-depleted cells in comparison to control cells (Figure 1Ba), as reported previously (Li et al, 2003). However in Skp2-silenced cells, Cdt1 was still absent in Cyclin A-positive cells (Figure 1Bb, upper panel) and BrdU-positive cells (Supplementary Figure S1B), indicating that cell cycle-specific proteolysis of Cdt1 was maintained. In addition, degradation of Cdt1 following DNA damage was unaffected by Skp2 depletion (Figure 1Bb, lower panel). This argues against Skp2 being essential for Cdt1 proteolysis during S phase and after UV-irradiation. We also observed that Cdt1 was degraded in Skp2−/− MEFs similar to wild-type cells (Figure 1C). When whole-cell extracts were immunoblotted, p27 protein levels were highly increased in Skp2−/− MEF, but the Cdt1 protein level remained similar to that in Skp2+/+ MEF (Figure 1Ca). Consistently, Cdt1 was detected only in a subpopulation of both MEF cultures by IF (data not shown). After UV-irradiation, Cdt1 was degraded in both cultures with similar kinetics (Figure 1Cb). In addition to SCF-Skp2, the DDB1-Cul4 pathway has been implicated in Cdt1 degradation (Higa et al, 2003; Zhong et al, 2003; Hu et al, 2004). In order to investigate the requirement for DDB1 for Cdt1 proteolysis, siRNA for DDB1 was used. While UV-induced Cdt1 degradation was inhibited, as reported previously (Hu et al, 2004), Cdt1 was still correctly degraded in S–G2 cells (Supplementary Figure S2). These data indicate that neither Skp2 nor DDB1 are independently required for correct cell cycle-specific proteolysis of Cdt1. Six conserved amino acids at the Cdt1 N-terminus are essential for degradation after UV, while this motif and the Cy-containing region are separately involved in S–G2 degradation A fragment containing the N-terminal 1–189 amino acids of Cdt1 is degraded essentially the same as endogenous Cdt1 both in S–G2 phases (Nishitani et al, 2004) and after UV-irradiation (Supplementary Figure S3). To identify regions within the amino-terminus of Cdt1, which mediate proteolysis, a series of deletion constructs fused with 9myc-3NLS were made (Figure 2A) and cell lines stably expressing each construct to comparable levels were isolated (Figure 2B). In the control strain expressing 9myc-3NLS alone, the protein is stable in all cell cycle phases and after UV-irradiation (Supplementary Figure S4A). By assaying a series of constructs with progressively shorter Cdt1 N-terminal fragments (Figure 2C and Supplementary Figure S4), the N-terminal 28 amino acids were identified as sufficient to confer both UV-induced and S–G2-specific degradation. When the first 10 or 20 amino acids were deleted from the (1–101) N-terminal region of Cdt1 (construct (11–101) and (21–101)9myc-3NLS)), the protein became stable after UV-irradiation, while the S–G2 degradation was not affected (Figure 2D and Supplementary Figure S4D). When the N-terminus was further removed, the (38–101) protein became stable in S–G2 phases, as well as after UV-irradiation (Figure 2E). The results are summarized in Figure 2A (right side). These data show that the first 10 amino acids of Cdt1 are essential for degradation after UV-irradiation. For S–G2 degradation, two alternative explanations were possible: since both the 1–28 and 21–101 regions exhibited correct cell cycle proteolysis, which was lost in the 38–101 construct, either a region between amino acids 21–28 of Cdt1 was essential and sufficient to confer cell cycle-specific proteolysis, or redundant elements were present within the N-terminus. In order to discriminate between the two possibilities, a deletion construct of 1–51 lacking amino acids 22–31 was constructed. This protein was degraded correctly both after UV-irradiation and in S–G2 phase (Figure 2F). Taken together, the mutation analysis leads to the hypothesis that two regions, one within the first 20 amino acids of Cdt1 and a second one in the 21–101 region, are separately involved in S–G2 proteolysis. Figure 2.N-terminal domain analysis of Cdt1. (A) N-terminal constructs fused to 9myc3NLS. The results of the degradation assay for each construct during S–G2 phases and after UV are summarized on the right (D, degraded or S, stable). At the bottom, predicted regions required for proteolysis are shown as black bars. (B) Western blot analysis of stable cell lines, using an anti-myc antibody. Lane 1: 9myc3NLS only; lane 2: (1–151); lane 3: (1–101); lane 4: (1–51); lane 5: (1–34); lane 6: (1–28); lane 7: (11–101); lane 8: (21–101); lane 9: (38–101); and lane 10: (1–51) deleted of (22–31). (C) Asynchronously growing stable (1–28)9mycNLS cells were stained with anti-Cyclin A and anti-myc antibodies in the absence of UV treatment (upper panel) or 1 h after UV treatment (lower panel; UV). (D–F) Asynchronous populations of each cell line indicated were examined as in (C). Download figure Download PowerPoint In order to pinpoint the amino acids required for cell cycle proteolysis, we scanned the amino-terminus of Cdt1 for known motifs and phylogenetically conserved amino acids. Upon comparison of the N-terminal regions of human, mouse and Xenopus Cdt1 proteins, six conserved amino acids were detected within the first 10 amino acids of Cdt1 (Figure 3, referred to hereafter as the QXRVTDF-motif). To investigate if these amino acids are important, the six amino acids were changed to alanines in the (1–101) construct, to generate construct A6(1–101) 9myc-3NLS. The Cy-motif, present in amino acids 68RRL70 of Cdt1, previously shown to be required for CDK/Cyclin association and phosphorylation (Liu et al, 2004; Sugimoto et al, 2004) could be involved in cell cycle proteolysis, and was therefore mutated to alanines to generate construct Cy(1–101). Stable cell lines expressing Cy(1–101), A6(1–101) and the double mutant A6Cy(1–101) to comparable levels were isolated (Figure 3B and C). The Cy(1–101) mutant was correctly proteolysed both in S–G2 and following UV damage (Figure 3D). The A6(1–101) remained stable after UV-irradiation, demonstrating that the six conserved amino acids are essential for degradation after DNA damage, while it was still degraded in S–G2 phase (Figure 3E). Strikingly, the double mutant A6Cy(1–101) became stable both in S–G2 and after UV-irradiation (Figure 3F). Consistently, when the A6 mutation was introduced into the (1–28)9myc-3NLS construct, which was degraded in both cases (Figure 2C), the A6(1–28) 9myc-3NLS became stable in both situations (Supplementary Figure S4E). Figure 3.Two domains in the N-terminus are involved in degradation. (A) Alignment of N-terminal amino acids of human, mouse and Xenopus Cdt1. The six conserved amino acids were mutated to alanine to generate mutant A6. (B) (1–101) constructs with the indicated mutations that were fused with 9mycNLS. Their stability (D, degraded or S, stable) in S–G2 phases (S–G2) or after UV irradiation (UV) is summarized on the right. (C) Stable cell lines. Whole-cell extracts prepared from each cell line were blotted with anti-myc antibody (lane1: HeLa cell; lane 2: (1–101); lane 3: Cy(1–101); lane 4: A6(1–101); lane 5: A6Cy(1–101). (D–F) Each stable cell line indicated was stained with anti-Cyclin A and anti-myc antibodies in the absence of UV treatment (upper panel) or after UV irradiation (lower panel, UV) as indicated. Download figure Download PowerPoint We conclude that six phylogenetically conserved amino acids within the first 10 amino acids of Cdt1 mediate both the UV-induced and S–G2 degradation, while the Cy-dependent region is specific for S–G2 degradation. Two E3 ligases are involved in Cdt1 degradation Our mutational analysis indicated that two redundant pathways could confer S–G2-specific proteolysis of Cdt1, one requiring the first 10 amino acids of Cdt1 and a second Cy-motif dependant. In order to determine which E3 ligase(s) was responsible for each pathway, we combined cell lines expressing mutated forms of Cdt1 with inactivation of putative E3 ligases. SCF-Skp2 and DDB1-Cul4, which we showed above not to be independently required for Cdt1 cell cycle proteolysis, were good candidates for mediating the two pathways. Initial experiments using Cdt1 N-terminal fragments showed that siRNA-mediated silencing of Skp2 led to stabilization of the A6(1–101) mutant in S–G2 cells (Supplementary Figure S5A), while silencing of Cul4A and B led to stabilization of the (1–34)9myc-3NLS fragment, which lacks the Cy-motif, both following DNA damage and in S–G2 (Supplementary Figure S5B). These experiments led to the hypothesis that Skp2 may mediate the Cy-motif-dependent pathway, while Cul4A/B may mediate the QXRVTDF-motif-dependent pathway. In order to further investigate this hypothesis, we introduced the A6 and Cy mutations independently in the context of the full-length Cdt1. Since the Cy mutant had a defect in nuclear import (data not shown), three copies of the SV40 NLS together with a myc tag was fused to the C-terminus of all constructs, as illustrated in Figure 4A. Stable cell lines were isolated, which express each of these mutants to levels similar to endogenous Cdt1 (Figure 4B). WT-Cdt1-3NLSmyc was degraded correctly both after UV-irradiation and in S–G2, indicating that addition of 3NLSmyc at the C-terminus did not affect Cdt1 proteolysis (Supplementary Figure S5C). The full-length A6-Cdt1-3NLSmyc (A6-Cdt1) was stable after UV-irradiation (data not shown), but was degraded in S–G2 (Figure 4C; siLuc). As shown in Figure 4C, silencing of Skp2, but not of Cul4, by RNAi led to stabilization of A6-Cdt1 in S–G2, as marked by the appearance of Cdt1/Cyclin A double-positive cells. Consistently, A6-Cdt1 levels increased dramatically in Skp2-silenced cells on Western blot (Figure 4C). When the SCF-component Cul1 was silenced, A6-Cdt1, but not Cy-Cdt1, became stable in most Cyclin A-positive cells (Supplementary Figure S6). This shows that SCF-Skp2 is required for the degradation of A6-Cdt1 and is therefore likely to be the mediator of the Cy-dependent pathway leading to S–G2 degradation of Cdt1. Figure 4.Two regions are recognized by two E3 ubiquitin ligases. (A) Full-size Cdt1 constructs fused with 3NLSmyc; full WT-Cdt1- (WT), A6-Cdt1- (A6) and Cy-Cdt1-3NLSmyc (Cy). (B) Stable lines, lane1: HeLa; lane 2: WT; lane 3: A6; and lane 4: Cy. Whole-cell extracts were prepared from each stable cell line and immunoblotted with anti-Cdt1 antibodies. (C) Stabilization of full A6-Cdt1-3NLSmyc after Skp2 silencing. Cells were transfected with the indicated siRNA, and costained with anti-Cyclin A and anti-myc antibodies (left) or extracts were prepared to blot with the indicated antibodies (right). (D) Stabilization of full Cy-Cdt1-3NLSmyc after Cul4 (A+B) silencing. Cells were treated as in (C). (E, F). Stabilization of full Cy-Cdt1-3NLSmyc (Cy-Cdt1) after silencing of DDB1 or Cul4. Cells were transfected with the indicated siRNAs, and treated for immunofluorescence or Western blotting (WB) with the antibodies for indicated proteins (F). Cells stained (+) or not stained (−) for Cy-Cdt1 and Cyclin A were counted, and frequency is shown (%) (E). In all Western blots, the arrowheads indicate endogenous Cdt1, while arrows indicate the full-sized Cdt1 constructs fused with 3NLSmyc. Download figure Download PowerPoint In order to assess the involvement of DDB1-Cul4 in S–G2 degradation of Cdt1, the cell line expressing full Cy-Cdt1-3NLSmyc (Cy-Cdt1) was subjected to siRNA treatment. In this case, silencing of Cul4(A+B), but not of Skp2, led to stabilization of Cy-Cdt1 in S–G2 (Figure 4D). On WB, an increase in total Cy-Cdt1 levels was apparent following silencing of Cul4(A+B), as compared to siLuc-treated cells. Such an increase was not detected for the endogenous Cdt1 (Figure 4D and F). When DDB1 was silenced, the number of Cdt1/Cyclin A double-positive cells increased (Figure 4E and F). As compared to when Cul4A and Cul4B were silenced individually, when both Cul4A and Cul4B were silenced together, Cy-Cdt1 was expressed in the majority of cells in the population, whether Cyclin A positive or negative (Figure 4E and representative images in Figure 4D). Taken together, our data argue that DDB1-Cul4 mediates the QXRVTDF-motif-dependent proteolysis pathway, while Skp2 mediates the Cy-motif-dependent pathway. Finally, in order to address whether Skp2 and DDB1-Cul4 are the major E3 ligases required for proteolysis of endogenous Cdt1, or additional components could mediate S–G2 degradation of Cdt1 in their absence, endogenous Cdt1 levels were examined in HeLa cells following siRNA treatment for these factors. In control siLuc-treated cells, less than 3% of Cyclin A-positive/Cdt1-positive cells were detected. In the population of Skp2- or Cul4(A+B)-silenced HeLa cells, 20–30% of Cyclin A-positive cells showed Cdt1 signal (Figure 5A and C), while when Skp2 and Cul4(A+B) were cosilenced, approximately 70% of Cyclin A-positive cells became positive for Cdt1, showing that cell cycle-specific proteolysis of Cdt1 was severely abrogated. We noticed that, while DNA content was not significantly increased in Skp2 and Cul4(A+B) cosilenced cells, they had larger nuclei (Supplementary Figure S7). We conclude that SCF-Skp2 and DDB1-Cul4 are major mediators of the cell cycle-specific proteolysis of Cdt1. Figure 5.Stabilization of Cdt1 in S–G2 phases after cosilencing of Skp2 and Cul4. HeLa cells were transfected with the indicated siRNAs and examined by double immunofluorescence with anti-Cyclin A and anti-Cdt1 antibodies (A) or Western blotting (WB) with indicated antibodies (B). (C) Quantification of immunofluorescence images shown in (A). Percentage of cells stained (+) or not stained (−) for Cdt1 and Cyclin A is shown. Download figure Download PowerPoint The Cul4-containing complex is active only in S phase, while SCF-Skp2 during both S and G2 phases Cdt1 is degraded in Cyclin A-positive S- and G2-phase cells. To address more precisely during which phases each E3 is active, Cdt1 proteins were examined in cells arrested at early S phase by thymidine–aphidicolin (S–0 h), washed and released for 2 h (S–2 h) into S phase, and for 7 h, when most cells are in G2 (as shown by flow-cytometry analysis). Full WT-Cdt1-3NLSmyc was undetectable in S–0 h, S–2 h and G2 samples (Figure 6), similar to the endogenous Cdt1 protein in HeLa cells (Nishitani et al, 2001). Full A6-Cdt1-3NLSmyc was similarly degraded, indicating that SCF-Skp2 targets Cdt1 both in S and G2 phases. Strikingly, however, full Cy-Cdt1-3NLSmyc was stable in the G2 population. In addition, we notice

Histone modifications play an important role in epigenetic gene regulation and genome integrity. It remains largely unknown, however, how these modifications dynamically change in individual cells. By using fluorescently labeled specific antigen binding fragments (Fabs), we have developed a general method to monitor the distribution and global level of endogenous histone H3 lysine modifications in living cells without disturbing cell growth and embryo development. Fabs produce distinct nuclear patterns that are characteristic of their target modifications. H3K27 trimethylation-specific Fabs, for example, are concentrated on inactive X chromosomes. As Fabs bind their targets transiently, the ratio of bound and free molecules depends on the target concentration, allowing us to measure changes in global modification levels. High-affinity Fabs are suitable for mouse embryo imaging, so we have used them to monitor H3K9 and H3K27 acetylation levels in mouse preimplantation embryos produced by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer. The data suggest that a high level of H3K27 acetylation is important for normal embryo development. As Fab-based live endogenous modification labeling (FabLEM) is broadly useful for visualizing any modification, it should be a powerful tool for studying cell signaling and diagnosis in the future.

Abstract UHRF1-dependent ubiquitin signaling plays an integral role in the regulation of maintenance DNA methylation. UHRF1 catalyzes transient dual mono-ubiquitylation of PAF15 (PAF15Ub2), which regulates the localization and activation of DNMT1 at DNA methylation sites during DNA replication. Although the initiation of UHRF1-mediated PAF15 ubiquitin signaling has been relatively well characterized, mechanisms underlying its termination and how they are coordinated with the completion of maintenance DNA methylation have not yet been clarified. This study shows that deubiquitylation by USP7 and unloading by ATAD5 (ELG1 in yeast) are pivotal processes for the removal of PAF15 from chromatin. On replicating chromatin, USP7 specifically interacts with PAF15Ub2 in a complex with DNMT1. USP7 depletion or inhibition of the interaction between USP7 and PAF15 results in abnormal accumulation of PAF15Ub2 on chromatin. Furthermore, we also find that the non-ubiquitylated form of PAF15 (PAF15Ub0) is removed from chromatin in an ATAD5-dependent manner. PAF15Ub2 was retained at high levels on chromatin when the catalytic activity of DNMT1 was inhibited, suggesting that the completion of maintenance DNA methylation is essential for termination of UHRF1-mediated ubiquitin signaling. This finding provides a molecular understanding of how the maintenance DNA methylation machinery is disassembled at the end of the S phase.

DNA replication stress is a predominant cause of genome instability, a driver of tumorigenesis and malignant progression. Nucleoside analog-type chemotherapeutic drugs introduce DNA damage and exacerbate DNA replication stress in tumor cells. However, the mechanisms underlying tumor cytotoxicity triggered by the drugs are not fully understood. Here, we show that the fluorinated thymidine analog trifluridine (FTD), an active component of the chemotherapeutic drug trifluridine/tipiracil, delayed DNA synthesis by human replicative DNA polymerases. FTD acted as an inefficient deoxyribonucleotide triphosphate source (FTD triphosphate) and as an obstacle base (trifluorothymine) in the template DNA strand. At the cellular level, FTD decreased thymidine triphosphate in the dNTP pool and induced FTD triphosphate accumulation, resulting in replication fork stalling caused by FTD incorporation into DNA. DNA lesions involving single-stranded DNA were generated as a result of replication fork stalling, and the p53-p21 pathway was activated. Although FTD suppressed tumor cell growth irrespective of p53 status, tumor cell fate diverged at the G2/M phase transition according to p53 status; tumor cells with wild-type p53 underwent cellular senescence via mitosis skip, whereas tumor cells that lost wild-type p53 underwent apoptotic cell death via aberrant late mitosis with severely impaired separation of sister chromatids. These results suggest that DNA replication stress induced by a nucleoside analog-type chemotherapeutic drug triggers tumor cytotoxicity by determining tumor cell fate according to p53 status.

Abstract Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is a homo-trimeric clamp complex that serves as the molecular hub for various DNA transactions, including DNA synthesis and post-replicative mismatch repair. Its timely loading and unloading are critical for genome stability. PCNA loading is catalyzed by Replication factor C (RFC) and the Ctf18 RFC-like complex (Ctf18-RLC), and its unloading is catalyzed by Atad5/Elg1-RLC. However, RFC, Ctf18-RLC, and even some subcomplexes of their shared subunits are capable of unloading PCNA in vitro , leaving an ambiguity in the division of labor in eukaryotic clamp dynamics. By using a system that specifically detects PCNA unloading, we show here that Atad5-RLC, which accounts for only approximately 3% of RFC/RLCs, nevertheless provides the major PCNA unloading activity in Xenopus egg extracts. RFC and Ctf18-RLC each account for approximately 40% of RFC/RLCs, while immunodepletion of neither Rfc1 nor Ctf18 detectably affects the rate of PCNA unloading in our system. PCNA unloading is dependent on the ATP-binding motif of Atad5, independent of nicks on DNA and chromatin assembly, and inhibited effectively by PCNA-interacting peptides. These results support a model in which Atad5-RLC preferentially unloads DNA-bound PCNA molecules that are free from their interactors.

ABSTRACT Sensing and processing of DNA double-strand breaks (DSBs) are vital to genome stability. DSBs are primarily detected by the ATM checkpoint pathway, where the Mre11–Rad50–Nbs1 (MRN) complex serves as the DSB sensor. Subsequent DSB end resection promotes the transition from the ATM to the ATR checkpoint pathway, where replication protein A, MRN, and the Rad9–Hus1–Rad1 (9–1–1) checkpoint clamp serve as the DNA structure sensors. 9–1–1 and MRN recruit Topbp1, a critical checkpoint mediator that activates the ATR kinase. However, how multiple sensors contribute to regulating end resection and checkpoint activation remains ambiguous. Using DNA substrates that mimic extensively resected DSBs, we show here that MRN and 9–1–1 redundantly stimulate Dna2-dependent long-range end resection and ATR activation in Xenopus egg extracts. MRN serves as the loading platform for Dna2, ATM, and Topbp1. In contrast, 9–1–1 is dispensable for bulk Dna2 loading, and Topbp1 loading is interdependent with 9–1–1 in this pathway. ATR facilitates Mre11 phosphorylation and ATM dissociation. Our results delineate the molecular mechanism of and interplay between two redundant pathways that stimulate ATR checkpoint activation and long-range DSB end resection in vertebrates.