Abstract Klebsiella pneumoniae is one of the leading causes of nosocomial infections. Carbapenem-resistant (CR) K. pneumoniae are on the rise in India. The biofilm forming ability of K. pneumoni ae further complicates patient management. There is still a knowledge gap on the association of biofilm formation with patient outcome and carbapenem susceptibility, which is investigated in the present study. K. pneumoniae isolates from patients admitted in critical care units with catheters and ventilators were included. K. pneumoniae ( n = 72) were tested for antimicrobial susceptibility as recommended by CLSI 2019 and subjected to 96-well microtitre plate biofilm formation assay. Based on optical density at 570 nm isolates were graded as strong, moderate and weak biofilm formers. Subset of strong biofilm formers were subjected to whole genome sequencing and a core genome phylogenetic analysis in comparison with global isolates were performed. Biofilm formation was compared for an association with the carbapenem susceptibility and with patient outcome. Statistical significance, correlations and graphical representation were performed using SPSS v23.0. Phenotypic analyses showed a positive correlation between biofilm formation and carbapenem resistance. Planktonic cells observed to be susceptible in vitro exhibited higher MICs in biofilm structure. The biofilm forming ability had a significant association with the morbidity/mortality. Infections by stronger biofilm forming pathogens significantly (P<0.05) resulted in fewer ‘average days alive’ for the patient (3.33) in comparison to those negative for biofilms (11.33). Phylogenetic analysis including global isolates revealed the clear association of sequence types with genes for biofilm mechanism and carbapenem resistance. Carbapenemase genes were found specific to each clade. The known hypervirulent clone-ST23 with wcaG , magA , rmpA , rmpA2 and wzc with a lack of mutation for hyper-capsulation might be poor biofilm formers. Interestingly, ST15, ST16, ST307 and ST258 – reported global high-risk clones were wcaJ negative indicating the high potential of biofilm forming capacity. Genes wabG and treC for CPS, bcsA and pgaC for adhesins, luxS for quorum sensing were common in all clades in addition to genes for aerobactin ( iutA ), allantoin ( allS ), type I and III fimbriae ( fimA , fimH , mrkD ) and pili ( pilQ , ecpA ). This study is the first of its kind to compare genetic features of antimicrobial resistance with a spectrum covering most of the genetic factors for K. pneumoniae biofilm. These results highlight the importance of biofilm screening to effectively manage nosocomial infections by K. pneumoniae . Further, data obtained on epidemiology and associations of biofilm and antimicrobial resistance genetic factors will serve to enhance our understanding on biofilm mechanisms in K. pneumoniae .

Abstract Synechocystis sp . PCC 6803 ( Synechocystis ) is a highly promising organism for the production of diverse recombinant chemicals, including biofuels. However, conventional genetic engineering in Synechocystis is challenging due to its highly polyploid genome which not only leads to low product yields but also makes the recombinant organism less reliable for use in biomanufacturing. Due to its precision, effectiveness and reliability in a vast array of chassis, CRISPR/Cas9 has the potential of overcoming the drawbacks effected by a polyploid genome. Here we identified and developed an effective sgRNA for the knock-in of nucleotide sequences of varying lengths in the neutral site slr 0168 of polyploid Synechocystis using CRISPR/Cas9. The gene encoding digeranylgeranylglycerophospholipid reductase from Sulfolobus acidocaldarius and the methyl ketone operon from Solanum habrochaites were chosen as the exemplar nucleotide sequences for incorporation into the chromosome of Synechocystis . It is demonstrated here that our sgRNA design was effective for both knock-ins and that CRISPR/Cas9 achieves complete mutant segregation after a single step of selection and induction.

Abstract Purpose Our objective was to assess the efficacy of an ex vivo sheep corneal model as an alternative for live animal testing in screening drug cytotoxicity. In pursuit of this goal, we investigated the impact of two commonly used topical antibiotics, ciprofloxacin and gentamicin, on wound healing. Furthermore, we examined different antibiotic dosages and dosing regimens to understand their effects comprehensively. Methods The epithelium on ex viv o sheep corneas was removed with a scalpel, and the area was treated with ciprofloxacin (0.1, 0.3, and 1 mg mL -1 ), gentamicin (0.25, 1, and 3 mg mL -1 ), or phosphate-buffered saline (control). The corneas were exposed to treatments continuously or twice daily for ten minutes. Wound closure was observed by fluorescein retention and histological staining. Results Untreated corneas healed within 41 hours. Continuous exposure to both ciprofloxacin and gentamicin significantly reduced the corneal healing ability in a time- and concentration-dependent manner. Overall, ciprofloxacin was found to be more toxic than gentamycin. However, this model showed that the corneal epithelium could heal effectively when both antibiotics were administered intermittently. Conclusion Ciprofloxacin demonstrated greater inhibition of wound healing compared to gentamicin, aligning with in vivo studies. The administration of drops several times daily mitigated the toxic effects of antibiotics. The ex vivo sheep wound healing model holds promise as an alternative approach to in vivo toxicity testing, enabling the swift evaluation of novel antimicrobial treatments and eye drop additives.

Abstract Antibiotics in development are usually tested on rapidly dividing cells in a culture medium and do not reflect the complexity of infections in vivo , while testing in vivo is limited, expensive and ethically concerning. This often results in the development and subsequent prescription of antibiotics only targeting infections in which pathogens are undergoing rapid cell division and in case of persistent infections like keratitis leads to poor clinical outcomes such as impaired vision or loss of an eye. In this study, we demonstrate antibiotic tolerance of Pseudomonas aeruginosa strains PA01 and PA14 using the ex vivo porcine keratitis model in which bacterial physiology more closely mimics infections in vivo than in a culture medium. MBEC and MIC were used as a guideline to establish the concentration of applied antibiotics on tissue. Infected ex vivo porcine corneas were treated with therapeutically relevant concentrations of gentamicin, ciprofloxacin and chloramphenicol. Ciprofloxacin was the most potent across all tests demonstrating a positive correlation with MIC but not MBEC. Nonetheless, the results demonstrated that MIC and MBEC concentrations were not sufficient to clear infection even after 18 hours of continuous exposure to the tested antibiotics reflecting the need for novel antibiotics that can target the persistent subpopulation of these pathogens and the ability of the ex vivo keratitis model to be a relevant platform to identify novel antibiotics with suitable activities. There was a clear visual distinction between corneas infected with cytotoxic strain PA14 and invasive strain PA01. In this study, both strains PA14 and PA01 showed a high level of antibiotic tolerance, which suggests that in clinical settings the treatment approach could be similar regardless of the causative strain. Data summary The authors confirm all supporting data and protocols have been provided within the article or through supplementary data files.

The performance of microbial communities exploited by industry are largely optimised by manipulating process parameters, such as flow rates, growth conditions, and reactor parameters. Conversely, the composition of microorganisms used are often viewed as a black box. This is mostly due to the relatively high costs and technical expertise required to identify and quantify the microbial consortia, as well as limited tools to create functional assemblages. Unknown details about the interactions among species may impose a limit on how much microbial function can be optimised for industrial purposes. Here, a new workflow was developed for studying microbial consortia using high throughput, species and community specific measurements of growth rates and yields. Growth rate and yield among all single, pairwise, triple, quadruples, quintuple and sextuple combinations of six bacterial isolates on landfill leachate were evaluated. Additive, antagonistic (e.g. competitive) or synergistic (+/-) interactions can be inferred from the rate and yield data. We found that antagonistic interactions, which hinder growth and yield, were the dominant interaction type, with only a few synergistic interactions observed. Mixed effects models were used to investigate the relationship between interaction type and species richness (biodiversity). Community identity was found to be a more important factor in predicting yield determining interactions but not rate determining interactions. Species richness was a good predictor of rate determining interactions, with the most positive interactions happening at a low species richness. Regression tree analysis identified Lysinibacillus sp. as a keystone species, a genus previously associated with bioremediation. Its presence led to a drastic change in the function of the synthetic ecosystem, with both positive yield and rate determining interactions. We were able to infer interactions about specific pairs of species, and the competitive/synergistic tendencies of single species from only basic top-down growth measurements. In this way, we have demonstrated how factorial experiments using isolated microorganisms can be used to ultimately design synthetic consortia with desirable traits for industry.

Abstract Persistent antibiotic use results in the rise of antimicrobial resistance with limited or no choice for multidrug resistant (MDR) and extensively drug resistant (XDR) bacteria. This necessitates a need for alternative therapy to effectively combat clinical pathogens that are resistant to last resort antibiotics. The study investigates hospital sewage as a potential source of bacteriophages to control MDR/XDR bacterial pathogens. 81 samples were screened for phages against selected clinical pathogens. 10 phages were isolated against A. baumannii , 5 phages against K. pneumoniae and 16 phages obtained against P. aeruginosa . The novel phages were observed to be strain-specific with a complete growth inhibition of up to 6 hrs. Phage plus colistin combinations further reduced the MBEC of colistin up to 16 folds. Notably, cocktail of phages exhibited supreme efficacy with complete killing at 0.5-1 µg/ml colistin concentrations. Thus, phages specific to clinical strains has a higher edge in treating nosocomial pathogens with their proven anti-biofilm efficacy. In addition, analysis of phage genomes revealed close phylogenetic relations with phages reported from Europe, China and other neighbouring countries. This study serves as a reference and can be extended to other antibiotics and phage types to assess optimum synergistic combinations to combat various drug resistant pathogens in the ongoing AMR crisis.