Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most prevalent form of renal cancer, accounting for over 75% of cases. The asymptomatic nature of the disease contributes to late-stage diagnoses and poor survival. Highly vascularized and immune infiltrated microenvironment are prominent features of ccRCC, yet the interplay between vasculature and immune cells, disease progression and response to therapy remains poorly understood. Using droplet-based single-cell RNA sequencing we profile 50,236 transcriptomes from paired tumor and healthy adjacent kidney tissues. Our analysis reveals significant heterogeneity and inter-patient variability of the tumor microenvironment. Notably, we discover a previously uncharacterized vasculature subpopulation associated with epithelial-mesenchymal transition. The cell-cell communication analysis reveals multiple modes of immunosuppressive interactions within the tumor microenvironment, including clinically relevant interactions between tumor vasculature and stromal cells with immune cells. The upregulation of the genes involved in these interactions is associated with worse survival in the TCGA KIRC cohort. Our findings demonstrate the role of tumor vasculature and stromal cell populations in shaping the ccRCC microenvironment and uncover a subpopulation of cells within the tumor vasculature that is associated with an angiogenic phenotype.

ABSTRACT Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most prevalent form of renal cancer, accounting for over 75% of cases. The asymptomatic nature of the disease contributes to late-stage diagnoses and poor survival. Highly vascularized and immune infiltrated microenvironment are prominent features of ccRCC, yet the interplay between vasculature and immune cells, disease progression and response to therapy remains poorly understood. Using droplet-based single-cell RNA sequencing we profiled 50,236 transcriptomes from paired tumor and healthy adjacent kidney tissues. Our analysis revealed significant heterogeneity and inter-patient variability of the tumor microenvironment. Notably, we discovered a previously uncharacterized vasculature subpopulation associated with epithelial-mesenchymal transition. The cell-cell communication analysis revealed multiple modes of immunosuppressive interactions within the tumor microenvironment, including clinically relevant interactions between tumor vasculature and stromal cells with immune cells. The upregulation of the genes involved in these interactions was associated with worse survival in the TCGA KIRC cohort. Our findings demonstrate the role of tumor vasculature and stromal cell populations in shaping the ccRCC microenvironment and uncover a subpopulation of cells within the tumor vasculature that is associated with an invasive phenotype.

The development of a large variety of single-cell analytical methods has empowered researchers to explore diverse biological questions at the level of individual cells. Among these, droplet-based single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) methods have been particularly prevalent owning to their high-throughput capabilities and reduced reaction volumes. While commercial systems have contributed to the widespread adoption of droplet-based scRNA-seq, the relatively high cost impose limitations for profiling large numbers of samples. Moreover, as the scope and scale of single cell sequencing methods keeps expanding, the possibility to accommodate diverse molecular biology workflows and inexpensively profile multiple biospecimens simultaneously, becomes highly relevant. Herein, we present inDrops-2: an open-source scRNA-seq platform designed to profile fresh or preserved clinical samples with a sensitivity matching that of state-of-the-art commercial systems, yet at the few folds lower cost. Using inDrops-2, we conducted a comparative analysis of two prominent scRNA-seq protocols - those based on exponential and linear amplification of cDNA - and provide new insights about the technical biases inherited to each approach. Finally, we applied inDrops-2 to simultaneously profile 18 lung carcinoma samples, all in one run following cell dehydration, long-term storage and multiplexing, to obtain a multiregional cellular profile of tumor microenvironment; thus, inDrops-2 offers researchers a possibility to perform large scale transcriptomics studies in a cost-effective manner.