Summary Single-cell sequencing has revolutionized our understanding of cellular heterogeneity by providing a micro-level perspective over the past decades. Although heterogeneity is essential for various biological communities, the currently demonstrated platform predominantly focuses on eukaryotic cells without cell walls and their transcriptomics 1,2 , leaving significant gaps in the study of omics from other single biological entities such as bacteria and viruses. Due to the difficulty of isolating and acquiring their DNA 3 , contemporary methodologies for the characterization of generic biological entities remain conspicuously constrained, with low throughput 4 , compromised lysis efficiency 5 , and highly fragmented genomes 6 . Herein, we present the Generic Single Entity Sequencing platform (GSE-Seq), which boasts ample versatility, high throughput, and high coverage, and is enabled by an innovative workflow, addressing the critical challenges in single entities sequencing: (1) one-step manufacturing of massive barcodes, (2) degradable hydrogel-based in situ sample processing and whole genome amplification, (3) integrated in-drop library preparation, (4) compatible long-read sequencing. By GSE-Seq, we have achieved a significant milestone by enabling high-throughput, long-read single-entity profiling of dsDNA and ssDNA from single virus sequencing (SV-seq) and single bacteria sequencing (SB-seq) of the human gut and marine sediment for the first time. Notably, our analysis uncovered previously overlooked viral and bacterial dark matter and phage-host interactions. In summary, the presented conceptually new workflow offers a toolbox based on droplet microfluidics to tackle the persistent challenges in high-throughput profiling to generic applications, which hold immense promise for diverse biological entities, especially hard-to-lyse cells.

Removing volumes from droplets is a challenging but critical step in many droplet-based applications. Geometry-mediated droplet splitting has the potential to reliably divide droplets and thus facilitate the implementation of this step. In this paper, we report the design of multi-furcating microfluidic channels for efficient droplet splitting. We studied the splitting regimes as the size of the mother droplets varied and investigated the effect of channel lengths. We further examined the droplet breakup mechanisms. This study could potentially be applied in washing steps in droplet-based biological assays or assays that require aliquot.

Single-cell RNA sequencing examines the transcriptome of individual cells and reveals the inter-cell transcription heterogeneity, playing a critical role in both scientific research and clinical applications. Recently, droplet microfluidics-based platform for expression profiling has been shown as a powerful tool to capture of the transcriptional information on single cell level. Despite the breakthrough this platform brought about, it required the simultaneous encapsulation of single cell and single barcoded bead, the incidence of which was very low. Suboptimal capturing efficiency limited the throughput of the Drop-seq platform. In this work, we leveraged the advance in inertial microfluidics-based cell sorting and designed a microfluidic chip for high efficiency cell-bead co-encapsulation, increasing the capturing rate by more than four folds. Specifically, we adopted spiral and serpentine channels and ordered cells/beads before the encapsulation region. We characterized the effect of cell concentration on the capturing rate and achieved a cell-bead co-capturing rate up to 3%. We tested this platform by co-encapsulating barcoded beads and human-mouse cell mixtures. The sequencing data distinguished the majority of human and mice expressions, with the doublet rate being as low as 5.8%, indicating that the simultaneous capturing of two or more cells in one droplet was minimal even when using high cell concentration. This chip design showed great potential in improving the efficiency for future single cell expression profiling.