ABSTRACT Emerging evidence suggests that cell signaling outcomes depend not only on the signal strength but also on its temporal progression. Our lab employs Fluorescence Lifetime Imaging of Resonance Energy Transfer (FLIM/FRET) biosensors to study intracellular signaling dynamics. We studied activation of β1 receptors by Isoproterenol, which triggers cAMP signaling via the G protein G αs , using two different FLIM microscopes: a widefield frequency domain FLIM (fdFLIM) setup and a fast confocal Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) setup. When comparing results from each FLIM setup, unexpectedly we obtained distinctively different cAMP kinetics: fdFLIM recording of cAMP in HeLa and Cos7 cells yielded transient responses, reminiscent of rapid receptor desensitization, while TCSPC recordings exhibited sustained responses lasting over 30 minutes. We initially suspected phototoxicity due to the intense light locally in the laser focus spot in confocal microscopy to interfere with normal termination of signal transduction and set out to map photosensitive steps in the signaling cascade in detail. We find no evidence for light-sensitivity in either generation or breakdown of cAMP, but rather, our findings show that the kinetic differences are due to selective degradation of β1 agonists on the fdFLIM setup. Agonist degradation appeared due to the commercial FluoroBrite medium, even though this has been specifically advertised to lower phototoxicity and reduce autofluorescence. Mass spectrometry identified Folic acid, an undisclosed constituent of FluoroBrite, as the culprit leading to artifacts in fdFLIM measurements. In all, our study underscores the impact of subtle phototoxicity effects on experimental outcome, and it shows that in this case confocal TCSPC provides the more reliable data needed to study response kinetics. This work also emphasizes the it is crucial that scientific vendors fully disclose chemical formulations.

Abstract Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) is an intrinsically quantitative method to screen for protein-protein interactions and frequently used to record the outcome of signal transduction events. With new highly sensitive and photon efficient FLIM instrumentation, the technique also becomes attractive to screen, with high temporal resolution, for fast changes in Förster Resonance Energy Transfer (FRET), such as those occurring upon activation of cell signaling. We studied the effects of siRNA-mediated individual knockdown of an extensive set of 22 different phosphodiesterases (PDEs) on baseline levels and agonist-induced changes of the second messenger cAMP. Using HeLa cells stably expressing our FRET-FLIM sensor we imaged many hundreds of cells at 5 second intervals for each condition. Following segmentation of cells by the deep-learning implementation Cellpose, FLIM time traces were calculated and fitted for dynamic analysis with custom-made Python scripts. Taking advantage of the quantitative FLIM data, we found very limited effects of PDE knockdown on baseline and agonist-induced peak levels of cAMP. However, cAMP breakdown in the decay phase was significantly slower when PDE3A and, to a lesser amount, PDE10A were knocked down, identifying these isoforms as dominant in HeLa cells. In conclusion, we present a robust platform that combines photon-efficient FLIM instrumentation with systematic gene knockdown and an automated open-source analysis pipeline. Our quantitative platform provides detailed kinetic analysis of cellular signals in individual cells with unprecedented throughput.

The outcome of cell signaling depends not only on signal strength but also on temporal progression. We use Fluorescence Lifetime Imaging of Resonance Energy Transfer (FLIM/FRET) biosensors to investigate intracellular signaling dynamics. We examined the β1 receptor-G