VEGF-targeted antiangiogenic therapy for cancers has been principally used but also faced a limitation due to resistance and adverse effects in clinical application. This observation further endorses the need for novel anti-angiogenesis molecules and/or understanding of the mechanisms of tumor angiogenesis before clinical trial. In the present study, we investigated the antiangiogenic properties of a novel 14-mer antiangiogenic peptide (14-MAP) derived from N-terminal 14kDa buffalo prolactin, followed by an exploration of its mode of action. 14-MAP at the picomolar concentration inhibited VEGF- and bradykinin (an autacoid peptide expressed in vascular tissues in pathophysiology)-stimulated endothelial nitric oxide (eNO) production, cell migration and proliferation in endothelial cells and vessel development in chick embryo. The crucial inhibitory effects of the peptide, however, were presented on the bradykinin-dependent angiogenic properties. Moreover, the interference of 14-MAP with the eNO synthase (eNOS)-cyclic GMP pathway was identified. A combination of low dose of Avastin, a widely used drug targeting VEGF-dependent angiogenesis, and 14-MAP significantly reduced tumor size in a mouse model of human colon cancer. These results suggest that 14-MAP, a bradykinin- and eNOS-dependent antiangiogenic peptide, can be useful for overcoming the limitation of VEGF-targeted antiangiogenic therapy in cancer patients.

Abstract Background and Aim Cellular senescence of hepatocytes involves permanent cell cycle arrest, disrupted cellular bioenergetics, resistance to cell death, and the release of pro-inflammatory cytokines. This ’zombie-like’ state perpetuates harmful effects on tissues and holds potential implications for liver disease progression. Remarkably, senescence exhibits heterogeneity, stemming from two crucial factors: the inducing stressor and the cell type. As such, our present study endeavors to characterize stressor-specific changes in senescence phenotype, its related molecular patterns, and cellular bioenergetics in primary mouse hepatocytes (PMH) and hepatocyte-derived liver organoids (HepOrgs). Methods PMH, isolated by collagenase-perfused mouse liver (C57B6/J; 18-23 weeks), were cultured overnight in William’s E-medium supplemented with 2% FBS, L-glutamine, and hepatocyte growth supplements. HepOrgs were developed by culturing cells in a 3D matrix for two weeks. The senescence was induced by DNA damage (doxorubicin, cisplatin, and etoposide), oxidative stress (H 2 O 2 , and ethanol), and telomere inhibition (BIBR-1532), p53 activation (nutlin-3a), DNA methyl transferase inhibition (5-azacitidine), and metabolism inhibitors (galactosamine and hydroxyurea). SA-β galactosidase activity, immunofluorescence, immunoblotting, and senescence-associated secretory phenotype (SASP), and cellular bioenergetics were used to assess the senescence phenotype. Results Each senescence inducer triggers a unique combination of senescence markers in hepatocytes. All senescence inducers, except hydroxyurea and ethanol, increased SA-β galactosidase activity, the most commonly used marker for cellular senescence. Among the SASP factors, CCL2 and IL-10 were consistently upregulated, while Plasminogen activator inhibitor-1 exhibited global downregulation across all modes of senescence. Notably, DNA damage response was activated by DNA damage inducers. Cell cycle markers were most significantly reduced by doxorubicin, cisplatin, and galactosamine. Additionally, DNA damage-induced senescence shifted cellular bioenergetics capacity from glycolysis to oxidative phosphorylation. Conclusion In our study, we demonstrated that each senescence inducer activates a unique combination of senescence markers in PMH. Doxorubicin demonstrated the highest efficacy in inducing senescence, followed by cisplatin and H 2 O 2 , with no impact on apoptosis. Each inducer prompted DNA damage response and mitochondrial dysfunction, independent of MAPK/AKT. Graphical abstract