Abstract Protein structure and dynamics can be probed using X-ray crystallography. Whereas the Bragg peaks are only sensitive to the average unit-cell electron density, the signal between the Bragg peaks -- diffuse scattering -- is sensitive to spatial correlations in electron-density variations. Although diffuse scattering contains valuable information about protein dynamics, the diffuse signal is more difficult to isolate from the background compared to the Bragg signal, and the reproducibility of diffuse signal is not yet well understood. We present a systematic study of the reproducibility of diffuse scattering from isocyanide hydratase (ICH) in three different protein forms. Both replicate diffuse datasets and datasets obtained from different mutants were similar in pairwise comparisons (Pearson correlation coefficient (CC) ≥0.8). The data were processed in a manner inspired by previously published methods using custom software with modular design, enabling us to perform an analysis of various data processing choices to determine how to obtain the highest quality data as assessed using unbiased measures of symmetry and reproducibility. The diffuse data then were used to characterize atomic mobility using a liquid-like motions (LLM) model. This characterization was able to discriminate between distinct anisotropic atomic displacement parameter (ADP) models arising from different anisotropic scaling choices that agreed comparably with the Bragg data. Our results emphasize the importance of data reproducibility as a model-free measure of diffuse data quality, illustrate the ability of LLM analysis of diffuse scattering to select among alternative ADP models, and offer insights into the design of successful diffuse scattering experiments.

Summary Paragraph Protein dynamics play an important role in enzyme catalysis[1][1]-[4][2]. Many enzymes form covalent catalytic intermediates that can alter enzyme structure and conformational dynamics[5][3],[6][4]. How these changes in enzyme structure and dynamics facilitate passage along the reaction coordinate is a fundamental unanswered question in structural enzymology. Here, we use Mix-and-Inject Serial Femtosecond X-ray Crystallography (MISC) at an X-ray Free Electron Laser (XFEL)[7][5]-[10][6], ambient temperature X-ray crystallography, computer simulations, and enzyme kinetics to characterize how covalent modification of the active site cysteine residue in isocyanide hydratase (ICH) alters the enzyme’s conformational ensemble throughout the catalytic cycle. With MISC, we directly observe formation of a thioimidate covalent intermediate during ICH catalysis. The intermediate exhibits changes in the active site electrostatic environment, disrupting a hydrogen bond and triggering a cascade of conformational changes in ICH. X-ray-induced formation of a cysteine-sulfenic acid at the catalytic nucleophile (Cys101-SOH) with conventional crystallography at ambient temperature induces similar conformational shifts, demonstrating that these enzyme motions result from cysteine modification. Computer simulations show how cysteine modification-gated structural changes allosterically propagate through the ICH dimer. Mutations at Gly150 that modulate helical mobility reduce ICH catalytic turnover and alter its pre-steady state kinetic behavior, establishing that helical mobility is important for ICH catalytic efficiency. Taken together, our results demonstrate the potential of mix-and-inject XFEL crystallography to capture otherwise elusive mechanistic details of enzyme catalysis and dynamics from microcrystalline samples[7][5],[11][7]. This approach can connect conformational dynamics to function for the large class of systems that rely on covalently modified cysteine residues for catalysis or regulation, resolving long-standing questions about enzyme mechanism and functionally relevant non-equilibrium enzyme motions. [1]: #ref-1 [2]: #ref-4 [3]: #ref-5 [4]: #ref-6 [5]: #ref-7 [6]: #ref-10 [7]: #ref-11

Abstract Redox reactions are central to biochemistry and are both controlled by and induce protein structural changes. Here we describe structural rearrangements and crosstalk within the Bacillus cereus ribonucleotide reductase R2b-NrdI complex, a di-metal carboxylate- flavoprotein system, as part of the mechanism generating the essential catalytic free radical of the enzyme. Femtosecond crystallography at an X-ray free-electron laser was utilized to obtain structures at room temperature in defined redox states without suffering photoreduction. We show that the flavin in the hydroquinone state is under steric strain in the R2b-NrdI protein complex, presumably tuning its redox potential to promote superoxide generation. Moreover, a binding site in close vicinity to the expected flavin O 2 -interacton site is observed to be controlled by the redox state of the flavin and linked to the channel proposed to funnel the produced superoxide species from NrdI to the di-manganese site in protein R2b. These specific features are coupled to further structural changes around the R2b- NrdI interaction surface. The mechanistic implications for the control of reactive oxygen species and radical generation in protein R2b are discussed.

ABSTRACT Human manganese superoxide dismutase (MnSOD) plays a crucial role in controlling levels of reactive oxygen species (ROS) by converting superoxide (O 2 •− ) to molecular oxygen (O 2 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) with proton-coupled electron transfers (PCETs). The reactivity of human MnSOD is determined by the state of a key catalytic residue, Tyr34, that becomes post-translationally inactivated by nitration in various diseases associated with mitochondrial dysfunction. We previously reported that Tyr34 has an unusual pK a due to its proximity to the Mn metal and undergoes cyclic deprotonation and protonation events to promote the electron transfers of MnSOD. To shed light on the role of Tyr34 MnSOD catalysis, we performed neutron diffraction, X-ray spectroscopy, and quantum chemistry calculations of Tyr34Phe MnSOD in various enzymatic states. The data identifies the contributions of Tyr34 in MnSOD activity that support mitochondrial function and presents a thorough characterization of how a single tyrosine modulates PCET catalysis.

Enzymes populate ensembles of structures with intrinsically different catalytic proficiencies that are difficult to experimentally characterize. We use time-resolved mix-and-inject serial crystallography (MISC) at an X-ray free electron laser (XFEL) to observe catalysis in a designed mutant (G150T) isocyanide hydratase (ICH) enzyme that enhances sampling of important minor conformations. The active site exists in a mixture of conformations and formation of the thioimidate catalytic intermediate selects for catalytically competent substates. A prior proposal for active site cysteine charge-coupled conformational changes in ICH is validated by determining structures of the enzyme over a range of pH values. A combination of large molecular dynamics simulations of the enzyme in crystallo and time-resolved electron density maps shows that ionization of the general acid Asp17 during catalysis causes additional conformational changes that propagate across the dimer interface, connecting the two active sites. These ionization-linked changes in the ICH conformational ensemble permit water to enter the active site in a location that is poised for intermediate hydrolysis. ICH exhibits a tight coupling between ionization of active site residues and catalysis-activated protein motions, exemplifying a mechanism of electrostatic control of enzyme dynamics.