Mutations in the type II receptor for bone morphogenetic protein (BMPR-II), a receptor member of the transforming growth factor-beta (TGF-beta) superfamily, underlie many familial and sporadic cases of primary pulmonary hypertension (PPH).Because the sites of expression of BMPR-II in the normal and hypertensive lung are unknown, we studied the cellular localization of BMPR-II and the related type I and II receptors for TGF-beta by immunohistochemistry in lung sections from patients undergoing heart-lung transplantation for PPH (n=11, including 3 familial cases) or secondary pulmonary hypertension (n=6) and from unused donor lungs (n=4). In situ hybridization was performed for BMPR-II mRNA. Patients were screened for the presence of mutations in BMPR2. In normal lungs, BMPR-II expression was prominent on vascular endothelium, with minimal expression in airway and arterial smooth muscle. In pulmonary hypertension cases, the intensity of BMPR-II immunostaining varied between lesions but involved endothelial and myofibroblast components. Image analysis confirmed that expression of BMPR-II was markedly reduced in the peripheral lung of PPH patients, especially in those harboring heterozygous BMPR2 mutations. A less marked reduction was also observed in patients with secondary pulmonary hypertension. In contrast, there was no difference in level of staining for TGF-betaRII or the endothelial marker CD31.The cellular localization of BMPR-II is consistent with a role in the formation of pulmonary vascular lesions in PPH, and reduced BMPR-II expression may contribute to the process of vascular obliteration in severe pulmonary hypertension.

Mutations in the type II receptor for bone morphogenetic protein (BMPR-II), a receptor member of the transforming growth factor-beta (TGF-beta) superfamily, underlie many cases of familial and sporadic primary pulmonary hypertension (PPH). We postulated that pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) from patients with PPH might demonstrate abnormal growth responses to TGF-beta superfamily members.For studies of (3)H-thymidine incorporation or cell proliferation, PASMCs (passages 4 to 8) were derived from main pulmonary arteries. In control cells, 24-hour incubation with TGF-beta(1) (10 ng/mL) or bone morphogenetic protein (BMP)-2, -4, and -7 (100 ng/mL) inhibited basal and serum-stimulated (3)H-thymidine incorporation, and TGF-beta(1) and BMPs inhibited the proliferation of serum-stimulated PASMCs. In contrast, TGF-beta(1) stimulated (3)H-thymidine incorporation (200%; P<0.001) and cell proliferation in PASMCs from PPH but not from patients with secondary pulmonary hypertension. In addition, BMPs failed to suppress DNA synthesis and proliferation in PASMCs from PPH patients. Reverse transcription-polymerase chain reaction of PASMC mRNA detected transcripts for type I (TGF-betaRI, Alk-1, ActRI, and BMPRIB) and type II (TGF-betaRII, BMPR-II, ActRII, ActRIIB) receptors. Receptor binding and cross-linking studies with (125)I-TGF-beta(1) confirmed that the abnormal responses in PPH cells were not due to differences in TGF-beta receptor binding. Mutation analysis of PASMC DNA failed to detect mutations in TGF-betaRII and Alk-1 but confirmed the presence of a mutation in BMPR-II in 1 of 5 PPH isolates.We conclude that PASMCs from patients with PPH exhibit abnormal growth responses to TGF-beta(1) and BMPs and that altered integration of TGF-beta superfamily growth signals may contribute to the pathogenesis of PPH.

BMP9 activates signaling through the BMPR-II receptor in endothelial cells and reverses established disease in three animal models of pulmonary hypertension, thus pointing to a potential new treatment for this disease. Genetic evidence implicates the loss of bone morphogenetic protein type II receptor (BMPR-II) signaling in the endothelium as an initiating factor in pulmonary arterial hypertension (PAH). However, selective targeting of this signaling pathway using BMP ligands has not yet been explored as a therapeutic strategy. Here, we identify BMP9 as the preferred ligand for preventing apoptosis and enhancing monolayer integrity in both pulmonary arterial endothelial cells and blood outgrowth endothelial cells from subjects with PAH who bear mutations in the gene encoding BMPR-II, BMPR2. Mice bearing a heterozygous knock-in allele of a human BMPR2 mutation, R899X, which we generated as an animal model of PAH caused by BMPR-II deficiency, spontaneously developed PAH. Administration of BMP9 reversed established PAH in these mice, as well as in two other experimental PAH models, in which PAH develops in response to either monocrotaline or VEGF receptor inhibition combined with chronic hypoxia. These results demonstrate the promise of direct enhancement of endothelial BMP signaling as a new therapeutic strategy for PAH.

Mutations in the bone morphogenetic protein type II receptor gene (BMPR2) are the major genetic cause of familial pulmonary arterial hypertension (FPAH). Although smooth muscle cell proliferation contributes to the vascular remodeling observed in PAH, the role of BMPs in this process and the impact of BMPR2 mutation remains unclear. Studies involving normal human pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) suggest site-specific responses to BMPs. Thus, BMP-4 inhibited proliferation of PASMCs isolated from proximal pulmonary arteries, but stimulated proliferation of PASMCs from peripheral arteries, and conferred protection from apoptosis. These differences were not caused by differential activation of BMP signaling pathways because exogenous BMP-4 led to phosphorylation of Smad1, p38(MAPK), and ERK1/2 in both cell types. However, the proproliferative effect of BMP-4 on peripheral PASMCs was found to be p38MAPK/ERK-dependent. Conversely, overexpression of dominant-negative Smad1 converted the response to BMP-4 in proximal PASMCs from inhibitory to proliferative. Furthermore, we confirmed that proximal PASMCs harboring kinase domain mutations in BMPR2 are deficient in Smad signaling and are unresponsive to the growth suppressive effect of BMP-4. Moreover, we show that the pulmonary vasculature of patients with familial and idiopathic PAH are deficient in the activated form of Smad1. We conclude that defective Smad signaling and unopposed p38(MAPK)/ERK signaling, as a consequence of mutation in BMPR2, underlie the abnormal vascular cell proliferation observed in familial PAH.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disorder with a poor prognosis. Deleterious variation within components of the transforming growth factor-β pathway, particularly the bone morphogenetic protein type 2 receptor (BMPR2), underlies most heritable forms of PAH. To identify the missing heritability we perform whole-genome sequencing in 1038 PAH index cases and 6385 PAH-negative control subjects. Case-control analyses reveal significant overrepresentation of rare variants in ATP13A3, AQP1 and SOX17, and provide independent validation of a critical role for GDF2 in PAH. We demonstrate familial segregation of mutations in SOX17 and AQP1 with PAH. Mutations in GDF2, encoding a BMPR2 ligand, lead to reduced secretion from transfected cells. In addition, we identify pathogenic mutations in the majority of previously reported PAH genes, and provide evidence for further putative genes. Taken together these findings contribute new insights into the molecular basis of PAH and indicate unexplored pathways for therapeutic intervention.

Hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT), the most common inherited vascular disorder, is caused by mutations in genes involved in the transforming growth factor beta (TGF-β) signaling pathway (ENG, ACVRL1, and SMAD4). Yet, approximately 15% of individuals with clinical features of HHT do not have mutations in these genes, suggesting that there are undiscovered mutations in other genes for HHT and possibly vascular disorders with overlapping phenotypes. The genetic etiology for 191 unrelated individuals clinically suspected to have HHT was investigated with the use of exome and Sanger sequencing; these individuals had no mutations in ENG, ACVRL1, and SMAD4. Mutations in BMP9 (also known as GDF2) were identified in three unrelated probands. These three individuals had epistaxis and dermal lesions that were described as telangiectases but whose location and appearance resembled lesions described in some individuals with RASA1-related disorders (capillary malformation-arteriovenous malformation syndrome). Analyses of the variant proteins suggested that mutations negatively affect protein processing and/or function, and a bmp9-deficient zebrafish model demonstrated that BMP9 is involved in angiogenesis. These data confirm a genetic cause of a vascular-anomaly syndrome that has phenotypic overlap with HHT. Hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT), the most common inherited vascular disorder, is caused by mutations in genes involved in the transforming growth factor beta (TGF-β) signaling pathway (ENG, ACVRL1, and SMAD4). Yet, approximately 15% of individuals with clinical features of HHT do not have mutations in these genes, suggesting that there are undiscovered mutations in other genes for HHT and possibly vascular disorders with overlapping phenotypes. The genetic etiology for 191 unrelated individuals clinically suspected to have HHT was investigated with the use of exome and Sanger sequencing; these individuals had no mutations in ENG, ACVRL1, and SMAD4. Mutations in BMP9 (also known as GDF2) were identified in three unrelated probands. These three individuals had epistaxis and dermal lesions that were described as telangiectases but whose location and appearance resembled lesions described in some individuals with RASA1-related disorders (capillary malformation-arteriovenous malformation syndrome). Analyses of the variant proteins suggested that mutations negatively affect protein processing and/or function, and a bmp9-deficient zebrafish model demonstrated that BMP9 is involved in angiogenesis. These data confirm a genetic cause of a vascular-anomaly syndrome that has phenotypic overlap with HHT. Hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT [MIM 187300 and 600376]) is an autosomal-dominantly inherited vascular-malformation syndrome characterized by telangiectases and arteriovenous malformations (AVMs) and has an incidence of 1 in 10,000 individuals.1Richards-Yutz J. Grant K. Chao E.C. Walther S.E. Ganguly A. Update on molecular diagnosis of hereditary hemorrhagic telangiectasia.Hum. Genet. 2010; 128: 61-77Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar Hallmark features are recurrent epistaxis due to telangiectases of the nasal mucosa; telangiectases on the lips, hands and oral mucosa; solid-organ AVMs, particularly of the lungs, liver, and brain; and a family history of the same. Presentation with three of these criteria is considered diagnostic for HHT.2Shovlin C.L. Guttmacher A.E. Buscarini E. Faughnan M.E. Hyland R.H. Westermann C.J. Kjeldsen A.D. Plauchu H. Diagnostic criteria for hereditary hemorrhagic telangiectasia (Rendu-Osler-Weber syndrome).Am. J. Med. Genet. 2000; 91: 66-67Crossref PubMed Scopus (1309) Google Scholar The dermal telangiectases are typically pinpoint to pinhead sized, very specifically concentrated on the hands, face and lips, and not diffuse. Telangiectases on the limbs and trunk are not characteristic. Currently, all known genetic defects that cause HHT are found within the transforming growth factor beta (TGF-β) signaling pathway. Mutations in endoglin (ENG [MIM 131195]), activin A receptor type II-like 1 (ACVRL1, also known as ALK1 [MIM 601284]), and SMAD4 (MIM 600993) cause HHT type 1, HHT type 2, and the combined juvenile polyposis (JP) and HHT (JP-HHT) syndrome, respectively.3McDonald M.T. Papenberg K.A. Ghosh S. Glatfelter A.A. Biesecker B.B. Helmbold E.A. Markel D.S. Zolotor A. McKinnon W.C. Vanderstoep J.L. et al.A disease locus for hereditary haemorrhagic telangiectasia maps to chromosome 9q33-34.Nat. Genet. 1994; 6: 197-204Crossref PubMed Scopus (160) Google Scholar, 4Johnson D.W. Berg J.N. Gallione C.J. McAllister K.A. Warner J.P. Helmbold E.A. Markel D.S. Jackson C.E. Porteous M.E. Marchuk D.A. A second locus for hereditary hemorrhagic telangiectasia maps to chromosome 12.Genome Res. 1995; 5: 21-28Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar, 5Gallione C.J. Repetto G.M. Legius E. Rustgi A.K. Schelley S.L. Tejpar S. Mitchell G. Drouin E. Westermann C.J. Marchuk D.A. A combined syndrome of juvenile polyposis and hereditary haemorrhagic telangiectasia associated with mutations in MADH4 (SMAD4).Lancet. 2004; 363: 852-859Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (562) Google Scholar Approximately 15% of individuals identified clinically as having HHT currently have no known genetic cause,6Gedge F. McDonald J. Phansalkar A. Chou L.S. Calderon F. Mao R. Lyon E. Bayrak-Toydemir P. Clinical and analytical sensitivities in hereditary hemorrhagic telangiectasia testing and a report of de novo mutations.J. Mol. Diagn. 2007; 9: 258-265Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (32) Google Scholar suggesting that there are undiscovered genes associated with HHT. Dermal telangiectases and cerebral AVMs are also features of capillary-malformation (CM)-AVM syndrome (CM-AVM [MIM 608354]), caused by mutations in RASA1 (MIM 139150).7Revencu N. Boon L.M. Mulliken J.B. Enjolras O. Cordisco M.R. Burrows P.E. Clapuyt P. Hammer F. Dubois J. Baselga E. et al.Parkes Weber syndrome, vein of Galen aneurysmal malformation, and other fast-flow vascular anomalies are caused by RASA1 mutations.Hum. Mutat. 2008; 29: 959-965Crossref PubMed Scopus (304) Google Scholar, 8Eerola I. Boon L.M. Mulliken J.B. Burrows P.E. Dompmartin A. Watanabe S. Vanwijck R. Vikkula M. Capillary malformation-arteriovenous malformation, a new clinical and genetic disorder caused by RASA1 mutations.Am. J. Hum. Genet. 2003; 73: 1240-1249Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (503) Google Scholar, 9Boon L.M. Mulliken J.B. Vikkula M. RASA1: variable phenotype with capillary and arteriovenous malformations.Curr. Opin. Genet. Dev. 2005; 15: 265-269Crossref PubMed Scopus (190) Google Scholar, 10Hershkovitz D. Bercovich D. Sprecher E. Lapidot M. RASA1 mutations may cause hereditary capillary malformations without arteriovenous malformations.Br. J. Dermatol. 2008; 158: 1035-1040Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar Recurrent nosebleeds have not been described, and the typical dermal telangiectases generally differ from HHT in location and appearance. The telangiectases seen in CM-AVM include both the small punctate lesions that characterize HHT and the larger telangiectases referred to as CMs. The punctate telangiectases in CM-AVM are more commonly diffuse and tend to cluster in a region of the trunk or limbs (M. Vikkula, personal communication). We first performed exome sequencing in 38 unrelated individuals reported to have HHT2Shovlin C.L. Guttmacher A.E. Buscarini E. Faughnan M.E. Hyland R.H. Westermann C.J. Kjeldsen A.D. Plauchu H. Diagnostic criteria for hereditary hemorrhagic telangiectasia (Rendu-Osler-Weber syndrome).Am. J. Med. Genet. 2000; 91: 66-67Crossref PubMed Scopus (1309) Google Scholar (by physicians who had ordered HHT genetic testing) but in whom no mutation had been identified in ENG, ACVRL1 or SMAD4. Informed consent was obtained from all individuals (approved by the institutional review board [00028740] at the University of Utah). Samples were enriched with the use of exome-targeted biotinylated RNA baits (SureSelect 50 Mb) and sequenced with 2× 100 bp paired-end reads (HiSeq2000, Illumina). The Burrows-Wheeler Aligner (0.5.9)11Li H. Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.Bioinformatics. 2009; 25: 1754-1760Crossref PubMed Scopus (26860) Google Scholar and the Genome Analysis Toolkit (v.1.6)12McKenna A. Hanna M. Banks E. Sivachenko A. Cibulskis K. Kernytsky A. Garimella K. Altshuler D. Gabriel S. Daly M. DePristo M.A. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.Genome Res. 2010; 20: 1297-1303Crossref PubMed Scopus (14887) Google Scholar were used for data analysis. To reduce the number of false-positive variant calls, we used raw variant sets as input to a Variant Quality Score Recalibration procedure, and we discarded resulting variants with VQRLOD scores less than −10.0. We prioritized variants by subjecting them to a two-part classification procedure. First, we computed SIFT,13Ng P.C. Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.Nucleic Acids Res. 2003; 31: 3812-3814Crossref PubMed Scopus (4100) Google Scholar PolyPhen-2,14Adzhubei I.A. Schmidt S. Peshkin L. Ramensky V.E. Gerasimova A. Bork P. Kondrashov A.S. Sunyaev S.R. A method and server for predicting damaging missense mutations.Nat. Methods. 2010; 7: 248-249Crossref PubMed Scopus (9342) Google Scholar MutationTaster,15Schwarz J.M. Rödelsperger C. Schuelke M. Seelow D. MutationTaster evaluates disease-causing potential of sequence alterations.Nat. Methods. 2010; 7: 575-576Crossref PubMed Scopus (2132) Google Scholar GERP++,16Davydov E.V. Goode D.L. Sirota M. Cooper G.M. Sidow A. Batzoglou S. Identifying a high fraction of the human genome to be under selective constraint using GERP++.PLoS Comput. Biol. 2010; 6: e1001025Crossref PubMed Scopus (1017) Google Scholar PhyloP,17Pollard K.S. Hubisz M.J. Rosenbloom K.R. Siepel A. Detection of nonneutral substitution rates on mammalian phylogenies.Genome Res. 2010; 20: 110-121Crossref PubMed Scopus (1302) Google Scholar LRT,18Chun S. Fay J.C. Identification of deleterious mutations within three human genomes.Genome Res. 2009; 19: 1553-1561Crossref PubMed Scopus (681) Google Scholar and SiPhy19Garber M. Guttman M. Clamp M. Zody M.C. Friedman N. Xie X. Identifying novel constrained elements by exploiting biased substitution patterns.Bioinformatics. 2009; 25: i54-i62Crossref PubMed Scopus (230) Google Scholar scores for all nonsynonymous variants. We computed scores by consulting a precomputed database of all possible scores distributed with the dbNSFP package, version 2.0.20Liu X. Jian X. Boerwinkle E. dbNSFP: a lightweight database of human nonsynonymous SNPs and their functional predictions.Hum. Mutat. 2011; 32: 894-899Crossref PubMed Scopus (513) Google Scholar We combined these scores into a single value by using a linear weighting scheme, and this value reflected the overall damage to the gene in question. Next, we employed phenotypic ranking by using the VarRanker algorithm (B.O., unpublished data). Pathogenic missense variants were identified in BMP9 (MIM 605120) in 2 of the 38 samples: c.254C>T (p.Pro85Leu) and c.203G>T (p.Arg68Leu) (Figures S1A and S1B, available online, and Table 1) (RefSeq accession number NM_016204.1). Neither BMP9 variant was present in publically available databases, the affected residues were highly conserved (from humans to zebrafish), and their corresponding mutations were predicted to be damaging by computing algorithms (Table S1).13Ng P.C. Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.Nucleic Acids Res. 2003; 31: 3812-3814Crossref PubMed Scopus (4100) Google Scholar, 14Adzhubei I.A. Schmidt S. Peshkin L. Ramensky V.E. Gerasimova A. Bork P. Kondrashov A.S. Sunyaev S.R. A method and server for predicting damaging missense mutations.Nat. Methods. 2010; 7: 248-249Crossref PubMed Scopus (9342) Google Scholar, 15Schwarz J.M. Rödelsperger C. Schuelke M. Seelow D. MutationTaster evaluates disease-causing potential of sequence alterations.Nat. Methods. 2010; 7: 575-576Crossref PubMed Scopus (2132) Google ScholarTable 1BMP9 Variants and Case PhenotypesIndividualClinical DescriptionNucleotide ChangeProtein ChangePresence in PopulationaPresence in population refers to the presence of the variant in 1000 Genomes, dbSNP, or 5,400 control exomes.Family SegregationVariant Classification1epistaxis, telangiectasia, first-degree relative reported to have HHTc.254C>Tp.Pro85LeuabsentNApathogenic2epistaxis, telangiectasia or CM (back, shoulders, mouth, face), AVM (thumb), parent and sibling with history of epistaxisc.203G>Tp.Arg68LeuabsentyesbFather and sister with epistaxis also carry the mutation.pathogenic3epistaxis, telangiectasia (80–100 on the left arm and shoulder, 2 on the right palm, 1 possible on the lip); a parent reports frequent epistaxis as a child and teenc.997C>TcIdentified by Sanger sequencing.p.Arg333TrpcIdentified by Sanger sequencing.0.004NAsuspected to be pathogenic4CM and hemihypertrophyc.−51C>AcIdentified by Sanger sequencing.5′ UTRcIdentified by Sanger sequencing.absentNAsuspected to be benignAll nucleotide changes were heterozygous. BMP9 RefSeq accession number NM_016204 was used. “NA” stands for not available.a Presence in population refers to the presence of the variant in 1000 Genomes, dbSNP, or 5,400 control exomes.b Father and sister with epistaxis also carry the mutation.c Identified by Sanger sequencing. Open table in a new tab All nucleotide changes were heterozygous. BMP9 RefSeq accession number NM_016204 was used. “NA” stands for not available. Next, BMP9 exons were Sanger sequenced in an additional 153 unrelated individuals who had been referred for molecular genetic testing as a result of suspicion of HHT by a referring physician, although most (86%) met two of the established diagnostic criteria for HHT and the other 14% met three diagnostic criteria. Another variant (c.997C>T [p.Arg333Trp]) was identified in one individual within this group (Figure S1C and Table 1). Although this variant has been previously reported in dbSNP (rs35129734), it is potentially disease causing because it is very rare (variant frequency of 0.004), the affected residue is strictly conserved among higher vertebrates, and the variant is predicted to be deleterious by SIFT,13Ng P.C. Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.Nucleic Acids Res. 2003; 31: 3812-3814Crossref PubMed Scopus (4100) Google Scholar PolyPhen-2,14Adzhubei I.A. Schmidt S. Peshkin L. Ramensky V.E. Gerasimova A. Bork P. Kondrashov A.S. Sunyaev S.R. A method and server for predicting damaging missense mutations.Nat. Methods. 2010; 7: 248-249Crossref PubMed Scopus (9342) Google Scholar and MutationTaster.15Schwarz J.M. Rödelsperger C. Schuelke M. Seelow D. MutationTaster evaluates disease-causing potential of sequence alterations.Nat. Methods. 2010; 7: 575-576Crossref PubMed Scopus (2132) Google Scholar All three individuals identified with a BMP9 mutation had dermal lesions described as telangiectases, yet a detailed review of the location and appearance of their lesions suggested a cutaneous phenotype that differs from classic HHT and has some resemblance to lesions described in individuals with RASA1-related disorders (CM-AVM). Therefore, BMP9 exons were also Sanger sequenced for 60 unrelated individuals who had been clinically suspected of having a mutation in RASA1 by their referring physician but in whom no mutation was identified in this gene. One variant not present in publically available databases was identified in the BMP9 5′ UTR region (c.−51C>A) in one individual (Table 1), who had macrocephaly, extensive CMs, and hemihypertrophy. Given that the individual’s unaffected mother had the same 5′ UTR variant, it is not likely that this variant causes the individual’s phenotype. Individual 1 (c.254C>T [p.Pro85Leu]) is a 33-year-old female whose onset of epistaxis occurred in early childhood. She reports that her nosebleeds were the most significant during childhood—they occurred two to six times a week—but were still significant enough in her twenties to warrant treatment by nasal cautery. She reported that she currently has approximately three nosebleeds a week but that they are minor in duration relative to how they were during childhood. She had several cutaneous telangiectases on her chest and face. No solid-organ AVMs were known, but she had not been screened for solid-organ AVMs. Her father died suddenly at the age of 45 years, and according to the family, HHT was suspected on the basis of autopsy findings. Unfortunately, this report was not available to confirm details, but it was the suggestion of HHT in her father years ago that led this individual to seek consultation regarding her epistaxis and cutaneous lesions. A sibling had recurrent spontaneous nosebleeds (approximately two per week) and a stroke of unknown etiology at the age of 43 years. No family members were available for examination or variant analysis. Individual 2 (c.203G>T [p.Arg68Leu]) is a 37-year-old female whose onset of epistaxis occurred at approximately 30 years of age. The frequency of her nosebleeds varied from daily to once every 1–2 weeks. The individual had 15–20 dermal vascular malformations on her face, mouth, upper chest, upper mid back, and hands, and they were first noticed when she was about 30 years old (Figure 1). The individual reported that the larger malformations had faded from a darker to lighter pink over time. An MRI of the brain did not show AVMs. Her father and sister reported infrequent but recurring nosebleeds, but they were not available for clinical examination. DNA was obtained from saliva, and the BMP9 c.203G>T (p.Arg68Leu) variant was identified in both the father and the sister. Individual 2 had abnormal liver enzymes and portal hypertension. A liver MRI showed findings suggestive of the hepatic vascular findings seen in HHT. In particular, the arterial phase was slightly heterogeneous, and several smaller branches of the hepatic artery were prominent and slightly corkscrew in configuration. Several small focal enhancing nodules were noted on the arterial phase that equilibrated in other phases and were not visible on other sequences, suggesting small focal nodular hyperplasia. However, this individual had also been diagnosed with hepatopulmonary syndrome, and the cause of her hepatic issues is not clear. Individual 3 (c.997C>T [p.Arg333Trp]) is a 14-year-old male whose onset of epistaxis occurred at approximately 3 years of age. Frequency of epistaxis had ranged from approximately once per week to several times per day. He had 80–100 telangiectases on his left upper extremity from wrist to shoulder, two telangiectases on the palm of his right hand, and one possible telangiectasia on his lower lip. The pathology report of a biopsy of the lesions confirmed them to be telangiectases. No solid-organ involvement (AVM) was known, but he was not screened by the referring physician. Per family history report, his father had nosebleeds of more than once per week in elementary school until his early teens, but none in recent years. DNA was not available from the father for variant analysis. To characterize the functional effects of the three BMP9 variants identified, we evaluated BMP9 levels and processing into the mature, active form of the protein21Brown M.A. Zhao Q. Baker K.A. Naik C. Chen C. Pukac L. Singh M. Tsareva T. Parice Y. Mahoney A. et al.Crystal structure of BMP-9 and functional interactions with pro-region and receptors.J. Biol. Chem. 2005; 280: 25111-25118Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar (Figure 2A). Comparison of plasmid-transfected human embryonic kidney (HEK) EBNA cell lysates and supernatants by immunoblot using an antibody specific to mature BMP9 revealed that the processing of the p.Arg68Leu and p.Arg333Trp variants to mature BMP9 was far less efficient than that of the wild-type (WT) BMP9, whereas processing of the p.Pro85Leu variant was less impaired (Figure 2B). This reduction of mature BMP9 in the supernatants was later confirmed with a specific ELISA in HEK cells (Figure 2C), as well as in the hepatoma cell line HepG2 (Figure S2). Importantly, control culture supernatants from HepG2 cells showed only low background levels of BMP9 (<10 pg/ml) (data not shown). Thus, all three variants altered BMP9 processing in vitro. Unfortunately, serum samples were not available for testing BMP9 levels in these individuals. To assess the relative activities of the WT and variant forms of BMP9, we examined their ability to induce BRE-luciferase activity in C2C12 cells transfected with human ALK1 (Figures 2D–2F). Assays of these BMP9 variants in C2C12 cells transfected with ALK1 revealed that the p.Arg68Leu and p.Pro85Leu variants exhibited less activity than did the WT BMP9 at 10 pg/ml (p.Arg68Leu: 79.2% ± 10.3% of WT; p.Pro85Leu: 82.2% ± 7.6% of WT) and 30 pg/ml (p.Arg68Leu: 78.9% ± 4.3% of WT; p.Pro85Leu: 78.6% ± 7.2% of WT) equivalent dilutions, but the p.Arg333Trp variant did not (10 pg/ml equivalent: 100.92% ± 11.8% of WT; 30 pg/ml equivalent: 99.6% ± 2.1% of WT) (Figure 2F). No luciferase activity was detected in the conditioned medium from HEK EBNA cells transfected with the empty pCEP4 vector (data not shown). We also tested the biological activity of the BMP9 variants by measuring production of alkaline phosphatase in the ATDC5 mouse chondrogenic cell line. Alkaline phosphatase is a widely accepted marker of the signaling pathway induced by different BMPs and by BMP9 in particular.22Miyazono K. Kamiya Y. Morikawa M. Bone morphogenetic protein receptors and signal transduction.J. Biochem. 2010; 147: 35-51Crossref PubMed Scopus (784) Google Scholar At the same protein concentration (1 ng/ml), the p.Arg68Leu, p.Pro85Leu, and p.Arg333Trp BMP9 variants showed less activity than did the WT protein (Figure 3). Taken together, these experiments demonstrate that the three BMP9 variants affect the biological activity of BMP9. Next, we performed bmp9 knockdown experiments in zebrafish to identify whether they would exhibit a vascular phenotype similar to HHT. Tg(kdrl:egfp)la116;Tg(gata1.DsRed2)sd2 zebrafish embryos23Choi J. Dong L. Ahn J. Dao D. Hammerschmidt M. Chen J.N. FoxH1 negatively modulates flk1 gene expression and vascular formation in zebrafish.Dev. Biol. 2007; 304: 735-744Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar, 24Traver D. Paw B.H. Poss K.D. Penberthy W.T. Lin S. Zon L.I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.Nat. Immunol. 2003; 4: 1238-1246Crossref PubMed Scopus (593) Google Scholar were injected at the 1- to 4-cell stage with 7 ng bmp9 translation-blocking morpholino (5′-GGAGCAAATGTCCTACGCGCCACAT-3′) or standard control morpholino (GeneTools). Compared to control morphants, bmp9 morphants exhibited small but significant decreases in both anterior-posterior and dorsal-ventral axes, but trunk and tail anatomy were otherwise normal (Figures 4A and 4B ). Vascular patterning in bmp9 morphants was relatively normal, although subtle defects were detected in maturation of the caudal vein. Although all control morphants exhibited a dominant ventral-vein return by 2 days postfertilization (dpf) (n = 86/86), in bmp9 morphants the caudal venous plexus failed to resolve and both dorsal and ventral veins continued to carry blood flow (n = 76/91, 83.5%; Figures 4C and 4D). This phenotype persisted as late as 5 dpf, suggesting that it was not the result of developmental delay but instead reflected impaired remodeling. Repeating the knockdown of bmp9 with a splice-blocking morpholino resulted in the same venous remodeling defect (data not shown), supporting a role for BMP9 in angiogenesis. In zebrafish, alk1 mutations result in robust cranial AVMs.25Corti P. Young S. Chen C.Y. Patrick M.J. Rochon E.R. Pekkan K. Roman B.L. Interaction between alk1 and blood flow in the development of arteriovenous malformations.Development. 2011; 138: 1573-1582Crossref PubMed Scopus (151) Google Scholar, 26Roman B.L. Pham V.N. Lawson N.D. Kulik M. Childs S. Lekven A.C. Garrity D.M. Moon R.T. Fishman M.C. Lechleider R.J. Weinstein B.M. Disruption of acvrl1 increases endothelial cell number in zebrafish cranial vessels.Development. 2002; 129: 3009-3019Crossref PubMed Google Scholar However, we detected no cranial AVMs in bmp9 morphants (n = 0/207), suggesting that other ligands such as BMP10 might compensate for BMP9 in the development of these cranial vessels (B.R., unpublished results). Overall, three missense variants in BMP9 were identified in 191 individuals with features of HHT. These three amino acids are conserved from humans through zebrafish, predicted to be damaging, and shown by in vitro studies to alter BMP9 processing to the mature form and BMP9 activity to varying degrees (Figures 2 and 3). Furthermore, knockdown of bmp9 in zebrafish resulted in defects in venous remodeling (Figure 4), supporting a role for BMP9 in angiogenesis. This is consistent with the reported role for BMP signaling during vascular development: blocking BMP9 with a neutralizing antibody in newborn mice significantly increased retinal vascular density.27Ricard N. Ciais D. Levet S. Subileau M. Mallet C. Zimmers T.A. Lee S.J. Bidart M. Feige J.J. Bailly S. BMP9 and BMP10 are critical for postnatal retinal vascular remodeling.Blood. 2012; 119: 6162-6171Crossref PubMed Scopus (175) Google Scholar Surprisingly, Bmp9-knockout mice did not show any vascular phenotype in retinal vascularization, and no abnormal retinal vascularization was noted in the three individuals with BMP9 variants. Furthermore, BMP9 specifically plays a physiologic role in the control of adult blood-vessel maintenance and angiogenesis by targeting ALK1 on endothelial cells.28David L. Mallet C. Mazerbourg S. Feige J.J. Bailly S. Identification of BMP9 and BMP10 as functional activators of the orphan activin receptor-like kinase 1 (ALK1) in endothelial cells.Blood. 2007; 109: 1953-1961Crossref PubMed Scopus (517) Google Scholar BMP9 exerts its functional effects by binding to specific endothelial cell surface receptors, namely the auxiliary receptor endoglin and the serine-threonine kinase ALK1, both members of the highly conserved TGF-β superfamily. Then, the BMP9-dependent activation of ALK1 leads to the phosphorylation of Smad1, Smad5, and Smad8, and the resulting phospho-Smad proteins associate with Smad4 to form a Smad complex that translocates to the nucleus to regulate gene expression in human microvascular endothelial cells. In addition, ALK1 activation by BMP9 further increases by overexpression of the coreceptor endoglin.28David L. Mallet C. Mazerbourg S. Feige J.J. Bailly S. Identification of BMP9 and BMP10 as functional activators of the orphan activin receptor-like kinase 1 (ALK1) in endothelial cells.Blood. 2007; 109: 1953-1961Crossref PubMed Scopus (517) Google Scholar Furthermore, BMP9 signaling via endoglin promotes a switch from a chemokine-responsive autocrine phenotype to a chemokine-nonresponsive paracrine state that represses endothelial cell migration and promotes vessel maturation.29Young K. Conley B. Romero D. Tweedie E. O’Neill C. Pinz I. Brogan L. Lindner V. Liaw L. Vary C.P. BMP9 regulates endoglin-dependent chemokine responses in endothelial cells.Blood. 2012; 120: 4263-4273Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar These data strongly suggest the involvement of BMP9 in a common TGF-β signaling pathway shared by ALK1, endoglin, and Smad4. Because mutations in ENG, ALK1, and SMAD4 give rise to different types of HHT (HHT1, HHT2, and JP-HHT, respectively), it can be postulated that alterations in BMP9, the upstream component of this signaling route, cause a vascular-malformation syndrome with phenotypic overlap with HHT (Figure 5). Supporting this view, many of the mutations described in ENG involve its orphan domain, a region responsible for binding to BMP9.30Fernández-L A. Sanz-Rodriguez F. Blanco F.J. Bernabéu C. Botella L.M. Hereditary hemorrhagic telangiectasia, a vascular dysplasia affecting the TGF-beta signaling pathway.Clin. Med. Res. 2006; 4: 66-78Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar, 31Castonguay R. Werner E.D. Matthews R.G. Presman E. Mulivor A.W. Solban N. Sako D. Pearsall R.S. Underwood K.W. Seehra J. et al.Soluble endoglin specifically binds bone morphogenetic proteins 9 and 10 via its orphan domain, inhibits blood vessel formation, and suppresses tumor growth.J. Biol. Chem. 2011; 286: 30034-30046Crossref PubMed Scopus (155) Google Scholar, 32Alt A. Miguel-Romero L. Donderis J. Aristorena M. Blanco F.J. Round A. Rubio V. Bernabeu C. Marina A. Structural and functional insights into endoglin ligand recognition and binding.PLoS ONE. 2012; 7: e29948Crossref PubMed Scopus (71) Google Scholar, 33Townson S.A. Martinez-Hackert E. Greppi C. Lowden P. Sako D. Liu J. Ucran J.A. Liharska K. Underwood K.W. Seehra J. et al.Specificity and structure of a high affinity activin receptor-like kinase 1 (ALK1) signaling complex.J. Biol. Chem. 2012; 287: 27313-27325Crossref PubMed Scopus (125) Google Scholar We observed that the p.Arg68Leu and p.Arg333Trp variants dramatically affected the degree of processing in the HEK EBNA expression system and thus reduced the amount of mature BMP9 that was being produced inside the expressing cells. Furthermore, the secretion of the mature and proBMP9 forms of the p.Arg68Leu and p.Arg333Trp variants was dramatically reduced. Intriguingly, the p.Pro85Leu variant also exhibited reduced levels of the proBMP9 form, but the processing was less impaired than in the other two variants. In addition to displaying changes in processing, the p.Arg68Leu and p.Pro85Leu BMP9 variants exhibited slightly reduced activity with ALK1. A reduction in activity is consistent with these mutations’ being in a region that might interact with ALK1.21Brown M.A. Zhao Q. Baker K.A. Naik C. Chen C. Pukac L. Singh M. Tsareva T. Parice Y. Mahoney A. et al.Crystal structure of BMP-9 and functional interactions with pro-region and receptors.J. Biol. Chem. 2005; 280: 25111-25118Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar We did not observe reduced activity of the p.Arg333Trp variant in our C2C12 activity assay, and we observed only a slight reduction in activity of the same variant in ATDC5 cells (Figure 3). This mutation might affect a region that binds to type II or type III receptors, including endoglin. In summary, it is likely that the different BMP9 variants each affect particular aspects of BMP9 processing, secretion, and receptor activity and thus lead to reduced functionality of BMP9. In our cohort of 191 individuals suspected to have HHT on examination by a referring physician, 3 (1.6%, or 0.24% of the total number of individuals with suspected HHT) of them were found to have a BMP9 variant. These three individuals all had epistaxis and dermal lesions described as telangiectases; however, the lesions were less concentrated on the hands and mouth than in individuals with mutations in ENG, ACVRL1, or SMAD4. In individual 2, the size and appearance of some lesions were more similar to the “atypical CM” seen in CM-AVM. In individual 3, the lesions were more punctate and resembled those in HHT in appearance, but the number and distribution were more typical of telangiectasia described in CM-AVM. The variants were shown to be present in two symptomatic first-degree relatives of one index case. However, no family members were available for examination by our group. Molecular screening of BMP9 in individuals suspected to have HHT should be considered in individuals with epistaxis and small blanching vascular lesions on the upper body and trunk rather than limited to the hands, face, and mouth (as is typical of HHT). It is of note that the individuals in this study, and many with HHT, have relatively infrequent, mild nosebleeds not routinely reported to physicians during medical history. Because of the small number of individuals presented here and the fact that evaluation for solid-organ AVMs was not routinely performed, little can be concluded about the presence or absence of internal AVMs in this disorder. However, in the one individual in which imaging of solid organs (brain, lungs, and liver) was performed, liver findings similar to those seen in HHT were noted. Interestingly, BMP9 has been reported to be predominantly expressed by the hepatocytes,34Bidart M. Ricard N. Levet S. Samson M. Mallet C. David L. Subileau M. Tillet E. Feige J.J. Bailly S. BMP9 is produced by hepatocytes and circulates mainly in an active mature form complexed to its prodomain.Cell. Mol. Life Sci. 2012; 69: 313-324Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar suggesting that the liver vasculature is a potential target of BMP9 deficiency. Continued molecular analysis and clinical description in families affected by various patterns of CM and/or telangiectases will lead to continued expansion and refinement of hereditary conditions characterized by cutaneous vascular lesions. Both will help guide proper surveillance and possible interventions for this group of individuals. We thank the families and individuals who participated in this study. This work was funded by the Associated Regional and University Pathologists Institute for Clinical and Experimental Pathology, a National Institutes of Health grant R01 (HL079108 to B.L.R.), a British Heart Foundation Programme grant (RG/08/002/24718 to N.W.M), and the Ministerio de Economia y Competitividad of Spain (SAF2010-19222 to C.B.). Download .pdf (.13 MB) Help with pdf files Document S1. Figures S1 and S2 and Table S1 The URLs for data presented herein are as follows:Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), http://www.omim.orgRefSeq, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq

Despite improved understanding of the underlying genetics, pulmonary arterial hypertension (PAH) remains a severe disease. Extensive remodeling of small pulmonary arteries, including proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs), characterizes PAH. MicroRNAs (miRNAs) are noncoding RNAs that have been shown to play a role in vascular remodeling.We assessed the role of miR-145 in PAH.We localized miR-145 in mouse lung to smooth muscle. Using quantitative PCR, we demonstrated increased expression of miR-145 in wild-type mice exposed to hypoxia. PAH was evaluated in miR-145 knockout and mice treated with anti-miRs via measurement of systolic right ventricular pressure, right ventricular hypertrophy, and percentage of remodeled pulmonary arteries. miR-145 deficiency and anti-miR-mediated reduction resulted in significant protection from the development of PAH. In contrast, miR-143 anti-miR had no effect. Furthermore, we observed upregulation of miR-145 in lung tissue of patients with idiopathic and heritable PAH compared with unaffected control subjects and demonstrated expression of miR-145 in SMC of remodeled vessels from such patients. Finally, we show elevated levels of miR-145 expression in primary PASMCs cultured from patients with BMPR2 mutations and also in the lungs of BMPR2-deficient mice.miR-145 is dysregulated in mouse models of PAH. Downregulation of miR-145 protects against the development of PAH. In patient samples of heritable PAH and idiopathic PAH, miR-145 is expressed in remodeled vessels and mutations in BMPR2 lead to upregulation of miR-145 in mice and PAH patients. Manipulation of miR-145 may represent a novel strategy in PAH treatment.

ABSTRACT Rationale Pulmonary endothelial permeability contributes to the high-permeability pulmonary edema that characterizes acute respiratory distress syndrome (ARDS), which carries a high mortality. Circulating bone morphogeneic protein 9 (BMP9) is emerging as an important regulator of pulmonary vascular homeostasis. Objective To determine whether endogenous BMP9 plays a role in preserving pulmonary endothelial integrity, and whether loss of endogenous BMP9 occurs during lipopolysacharride (LPS)-induced lung inflammation and permeability. Methods A BMP9-neutralizing antibody was administrated to healthy adult mice and lung vasculature was examined. Potential mechanisms were delineated by transcript analysis in human primary lung endothelial cells. Impact of BMP9 was evaluated in a murine acute lung injury model induced by inhaled LPS. Levels of BMP9 were measured in plasma from patients with sepsis and endotoxemic mice. Main Results Subacute neutralization of endogenous BMP9 in mice resulted in increased lung vascular permeability, interstitial edema and neutrophil extravasation. In lung endothelial cells, BMP9 regulated a programme of gene expression and pathways controlling vascular permeability and cell membrane integrity. Augmentation of BMP9 signalling in mice with exogenous BMP9 prevented inhaled LPS-caused lung injury and edema. In endotoxemic mice, endogenous BMP9 levels were markedly reduced, due to a transient reduction in hepatic BMP9 mRNA expression and increased elastase activity in plasma. In human sepsis patients, circulating levels of BMP9 were also markedly reduced. Conclusions Endogenous circulating BMP9 is a pulmonary endothelial protective factor, down-regulated during inflammation. Supplementation with exogenous BMP9 offers a potential therapy to prevent increased pulmonary endothelial permeability in the setting of lung injury. Short summary Scientific Knowledge on the Subject Increased pulmonary endothelial permeability is a major factor in the development of acute respiratory distress syndrome (ARDS). Evidence is emerging that circulating BMP9, secreted from the liver, might protect the pulmonary endothelium from injury. For example, loss of BMP9 levels or signalling receptor contributes to the development of pulmonary arterial hypertension. The role of endogenous BMP9 in endothelial permeability remains unclear. What This Study Adds to the Field Here we show that subacute neutralization of endogenous BMP9 leads to lung vascular injury, including enhanced permeability and neutrophil extravasation. BMP9 levels were markedly reduced in the setting of inflammation in mice and humans. Conversely, exogenous supplementation of BMP9 protected the lung from LPS-induced injury. This study suggests that exogenous BMP9 could offer a novel approach to prevent increased pulmonary endothelial permeability in the setting of lung injury and ARDS.

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare disorder with a poor prognosis. Deleterious variation within components of the transforming growth factor-β pathway, particularly the bone morphogenetic protein type 2 receptor (BMPR2), underlie most heritable forms of PAH. Since the missing heritability likely involves genetic variation confined to small numbers of cases, we performed whole genome sequencing in 1038 PAH index cases and 6385 PAH-negative control subjects. Case-control analyses revealed significant overrepresentation of rare variants in novel genes, namely ATP13A3, AQP1 and SOX17, and provided independent validation of a critical role for GDF2 in PAH. We provide evidence for familial segregation of mutations in SOX17 and AQP1 with PAH. Mutations in GDF2, encoding a BMPR2 ligand, led to reduced secretion from transfected cells. In addition, we identified pathogenic mutations in the majority of previously reported PAH genes, and provide evidence for further putative genes. Taken together these findings provide new insights into the molecular basis of PAH and indicate unexplored pathways for therapeutic intervention.