The differentiation and specificity of human CD4+ T follicular helper cells (TFH cells) after influenza vaccination have been poorly defined. Here we profiled blood and draining lymph node (LN) samples from human volunteers for over 2 years after two influenza vaccines were administered 1 year apart to define the evolution of the CD4+ TFH cell response. The first vaccination induced an increase in the frequency of circulating TFH (cTFH) and LN TFH cells at week 1 postvaccination. This increase was transient for cTFH cells, whereas the LN TFH cells further expanded during week 2 and remained elevated in frequency for at least 3 months. We observed several distinct subsets of TFH cells in the LN, including pre-TFH cells, memory TFH cells, germinal center (GC) TFH cells and interleukin-10+ TFH cell subsets beginning at baseline and at all time points postvaccination. The shift toward a GC TFH cell phenotype occurred with faster kinetics after the second vaccine compared to the first vaccine. We identified several influenza-specific TFH cell clonal lineages, including multiple responses targeting internal influenza virus proteins, and found that each TFH cell state was attainable within a clonal lineage. Thus, human TFH cells form a durable and dynamic multitissue network. Schattgen et al. profiled the subsets and clonality of CD4+ TFH cells in the blood and lymph nodes of human volunteers who received two influenza vaccines 1 year apart to characterize their dynamics and clonal evolution over 2 years.

Abstract We profiled blood and draining lymph node (LN) samples from human volunteers after influenza vaccination over two years to define evolution in the T follicular helper cell (TFH) response. We show LN TFH cells expanded in a clonal-manner during the first two weeks after vaccination and persisted within the LN for up to six months. LN and circulating TFH (cTFH) clonotypes overlapped but had distinct kinetics. LN TFH cell phenotypes were heterogeneous and mutable, first differentiating into pre-TFH during the month after vaccination before maturing into GC and IL-10+ TFH cells. TFH expansion, upregulation of glucose metabolism, and redifferentiation into GC TFH cells occurred with faster kinetics after re-vaccination in the second year. We identified several influenza-specific TFH clonal lineages, including multiple responses targeting internal influenza proteins, and show each TFH state is attainable within a lineage. This study demonstrates that human TFH cells form a durable and dynamic multi-tissue network.

The tonsils have been identified as a site of replication for Epstein-Barr virus, adenovirus, human papillomavirus, and other respiratory viruses. Human tonsil epithelial cells (HTECs) are a heterogeneous group of actively differentiating cells. Here, we investigated the cellular features and susceptibility of differentiated HTECs to specific influenza viruses, including expression of avian-type and mammalian-type sialic acid (SA) receptors, viral replication dynamics, and the associated cytokine secretion profiles. We found that differentiated HTECs possess more abundant α2,3-linked SA (preferentially bound by avian influenza viruses) than α2,6-linked SA (preferentially bound by mammalian strains). This dual receptor expression suggests a role in influenza virus adaptation and tropism within the tonsils by facilitating the binding and entry of multiple influenza virus strains. Our results indicated the susceptibility of differentiated HTECs to a wide range of influenza viruses from human, swine, and avian hosts. Virus production for most strains was detected as early as 1 day post-infection (dpi), and typically peaked by 3 dpi. However, pandemic H1N1 virus showed remarkably delayed replication kinetics that did not peak until at least 7 dpi. Notably, influenza virus infection impacted the expression of cytokeratins in HTEC cultures, which correlated with altered cytokine secretion patterns. These patterns varied within the strains but were most distinct in swine H3N2 infection. In conclusion, differentiated HTECs exhibited a strain-specific pattern of influenza virus replication and innate immune responses that included changes in cytokeratin and cytokine expression. These studies shed light on the complex interplay between influenza viruses and host cells in the tonsils. To develop effective interventions against influenza, it is important to identify host factors affecting pathogenesis and immune responses. Tonsils are lymphoepithelial organs characterized by infiltration of B and T lymphocytes into the squamous epithelium of tonsillar crypts, beneath which germinal centers play key roles in antigen processing and the immune response. Influenza virus tropism in the human upper respiratory tract is a key determinant of host-range, pathogenesis, and transmission. Accordingly, experimental models using primary cells from the human respiratory tract are relevant for assessing virus tropism and replication competence. Our study addresses the dynamics of influenza virus replication in HTECs, including cellular tropism, infectivity, and cytokeratin and cytokine expression. The results of this study highlight the complex interplay between structural proteins and immune signaling pathways, all of which provide valuable insights into host-virus interactions.