Sphingolipid signaling pathways have been implicated in many critical cellular events. Sphingosine-1-phosphate (SPP), a sphingolipid metabolite found in high concentrations in platelets and blood, stimulates members of the endothelial differentiation gene (Edg) family of G protein-coupled receptors and triggers diverse effects, including cell growth, survival, migration, and morphogenesis. To determine the in vivo functions of the SPP/Edg signaling pathway, we disrupted the Edg1 gene in mice. Edg1(-/-) mice exhibited embryonic hemorrhage leading to intrauterine death between E12.5 and E14.5. Vasculogenesis and angiogenesis appeared normal in the mutant embryos. However, vascular maturation was incomplete due to a deficiency of vascular smooth muscle cells/pericytes. We also show that Edg-1 mediates an SPP-induced migration response that is defective in mutant cells due to an inability to activate the small GTPase, Rac. Our data reveal Edg-1 to be the first G protein-coupled receptor required for blood vessel formation and show that sphingolipid signaling is essential during mammalian development.

NKT cells represent a distinct lineage of T cells that coexpress a conserved alphabeta T cell receptor (TCR) and natural killer (NK) receptors. Although the TCR of NKT cells is characteristically autoreactive to CD1d, a lipid-presenting molecule, endogenous ligands for these cells have not been identified. We show that a lysosomal glycosphingolipid of previously unknown function, isoglobotrihexosylceramide (iGb3), is recognized both by mouse and human NKT cells. Impaired generation of lysosomal iGb3 in mice lacking beta-hexosaminidase b results in severe NKT cell deficiency, suggesting that this lipid also mediates development of NKT cells in the mouse. We suggest that expression of iGb3 in peripheral tissues may be involved in controlling NKT cell responses to infections and malignancy and in autoimmunity.

Sphingosine-1-phosphate (S1P), an important sphingolipid metabolite, regulates diverse cellular processes, including cell survival, growth, and differentiation. Here we show that S1P signaling is critical for neural and vascular development. Sphingosine kinase-null mice exhibited a deficiency of S1P which severely disturbed neurogenesis, including neural tube closure, and angiogenesis and caused embryonic lethality. A dramatic increase in apoptosis and a decrease in mitosis were seen in the developing nervous system. S1P(1) receptor-null mice also showed severe defects in neurogenesis, indicating that the mechanism by which S1P promotes neurogenesis is, in part, signaling from the S1P(1) receptor. Thus, S1P joins a growing list of signaling molecules, such as vascular endothelial growth factor, which regulate the functionally intertwined pathways of angiogenesis and neurogenesis. Our findings also suggest that exploitation of this potent neuronal survival pathway could lead to the development of novel therapeutic approaches for neurological diseases.

Gangliosides are sialic acid-containing glycosphingolipids that are present on all mammalian plasma membranes where they participate in recognition and signaling activities. We have established mutant mice that lack GM3 synthase (CMP-NeuAc:lactosylceramide α2,3-sialyltransferase; EC 2.4.99.-). These mutant mice were unable to synthesize GM3 ganglioside, a simple and widely distributed glycosphingolipid. The mutant mice were viable and appeared without major abnormalities but showed a heightened sensitivity to insulin. A basis for the increased insulin sensitivity in the mutant mice was found to be enhanced insulin receptor phosphorylation in skeletal muscle. Importantly, the mutant mice were protected from high-fat diet-induced insulin resistance. Our results show that GM3 ganglioside is a negative regulator of insulin signaling, making it a potential therapeutic target in type 2 diabetes.

Bone is a dynamic tissue, constantly undergoing growth, remodelling and degradation. Central to these processes are the osteoclasts, bone-resorbing multinuclear giant cells that differentiate from mononuclear macrophage/monocyte-lineage haematopoietic precursors. Normally bone resorption is balanced by the activity of bone-forming osteoblasts, but in bone-destructive disorders such as osteoporosis, osteoclast activity outpaces osteoblast activity. Now using a mouse model of hormone-deprivation osteoporosis, the blood-born lipid mediator sphingosine-1-phosphate is identified as a key mediator of bone demineralization. It controls the migratory behaviour of osteoclast precursors, thereby regulating bone homeostasis. As a pivotal control point in osteoclastogenesis, sphingosine-1-phosphate may have potential, as a therapeutic target in bone-resorptive disorders. Osteoclasts resorb bone and their precursor cells express sphingosine-1-phosphate (S1P) receptors. Too much S1P, and too many osteoclast precursors move into the blood; too little S1P results in increased attachment to bone and osteoporosis. Furthermore, S1P receptor stimulation in live mice diminishes bone loss in a mouse model of postmenopausal osteoporosis. Osteoclasts are the only somatic cells with bone-resorbing capacity and, as such, they have a critical role not only in normal bone homeostasis (called ‘bone remodelling’) but also in the pathogenesis of bone destructive disorders such as rheumatoid arthritis and osteoporosis1. A major focus of research in the field has been on gene regulation by osteoclastogenic cytokines such as receptor activator of NF-κB-ligand (RANKL, also known as TNFSF11) and TNF-α, both of which have been well documented to contribute to osteoclast terminal differentiation2,3. A crucial process that has been less well studied is the trafficking of osteoclast precursors to and from the bone surface, where they undergo cell fusion to form the fully differentiated multinucleated cells that mediate bone resorption. Here we report that sphingosine-1-phosphate (S1P), a lipid mediator enriched in blood4,5, induces chemotaxis and regulates the migration of osteoclast precursors not only in culture but also in vivo, contributing to the dynamic control of bone mineral homeostasis. Cells with the properties of osteoclast precursors express functional S1P1 receptors and exhibit positive chemotaxis along an S1P gradient in vitro. Intravital two-photon imaging of bone tissues showed that a potent S1P1 agonist, SEW2871, stimulated motility of osteoclast precursor-containing monocytoid populations in vivo. Osteoclast/monocyte (CD11b, also known as ITGAM) lineage-specific conditional S1P1 knockout mice showed osteoporotic changes due to increased osteoclast attachment to the bone surface. Furthermore, treatment with the S1P1 agonist FTY720 relieved ovariectomy-induced osteoporosis in mice by reducing the number of mature osteoclasts attached to the bone surface. Together, these data provide evidence that S1P controls the migratory behaviour of osteoclast precursors, dynamically regulating bone mineral homeostasis, and identifies a critical control point in osteoclastogenesis that may have potential as a therapeutic target.

Glycosphingolipids (GSLs) are believed to be integral for the dynamics of many cell membrane events, including cellular interactions, signaling, and trafficking. We have investigated their roles in development and differentiation by eliminating the major synthesis pathway of GSLs through targeted disruption of the Ugcg gene encoding glucosylceramide synthase. In the absence of GSL synthesis, embryogenesis proceeded well into gastrulation with differentiation into primitive germ layers and patterning of the embryo but was abruptly halted by a major apoptotic process. In vivo , embryonic stem cells deficient in GSL synthesis were again able to differentiate into endodermal, mesodermal, and ectodermal derivatives but were strikingly deficient in their ability to form well differentiated tissues. In vitro , however, hematopoietic and neuronal differentiation could be induced. The results demonstrate that the synthesis of GSL structures is essential for embryonic development and for the differentiation of some tissues and support the concept that GSLs are involved in crucial cell interactions mediating these processes.

Sphingosine-1-phosphate (S1P), a lipid signaling molecule that regulates many cellular functions, is synthesized from sphingosine and ATP by the action of sphingosine kinase. Two such kinases have been identified, SPHK1 and SPHK2. To begin to investigate the physiological functions of sphingosine kinase and S1P signaling, we generated mice deficient in SPHK1. Sphk1 null mice were viable, fertile, and without any obvious abnormalities. Total SPHK activity in most Sphk1-/-tissues was substantially, but not completely, reduced indicating the presence of multiple sphingosine kinases. S1P levels in most tissues from the Sphk1-/- mice were not markedly decreased. In serum, however, there was a significant decrease in the S1P level. Although S1P signaling regulates lymphocyte trafficking, lymphocyte distribution was unaffected in lymphoid organs of Sphk1-/- mice. The immunosuppressant FTY720 was phosphorylated and elicited lymphopenia in the Sphk1 null mice showing that SPHK1 is not required for the functional activation of this sphingosine analogue prodrug. The results with these Sphk1 null mice reveal that some key physiologic processes that require S1P receptor signaling, such as vascular development and proper lymphocyte distribution, can occur in the absence of SPHK1. Sphingosine-1-phosphate (S1P), a lipid signaling molecule that regulates many cellular functions, is synthesized from sphingosine and ATP by the action of sphingosine kinase. Two such kinases have been identified, SPHK1 and SPHK2. To begin to investigate the physiological functions of sphingosine kinase and S1P signaling, we generated mice deficient in SPHK1. Sphk1 null mice were viable, fertile, and without any obvious abnormalities. Total SPHK activity in most Sphk1-/-tissues was substantially, but not completely, reduced indicating the presence of multiple sphingosine kinases. S1P levels in most tissues from the Sphk1-/- mice were not markedly decreased. In serum, however, there was a significant decrease in the S1P level. Although S1P signaling regulates lymphocyte trafficking, lymphocyte distribution was unaffected in lymphoid organs of Sphk1-/- mice. The immunosuppressant FTY720 was phosphorylated and elicited lymphopenia in the Sphk1 null mice showing that SPHK1 is not required for the functional activation of this sphingosine analogue prodrug. The results with these Sphk1 null mice reveal that some key physiologic processes that require S1P receptor signaling, such as vascular development and proper lymphocyte distribution, can occur in the absence of SPHK1. Sphingosine-1-phosphate (S1P) 1The abbreviations used are: S1P, sphingosine-1-phosphate; SPHK, sphingosine kinase; Sphk, mouse gene encoding sphingosine kinase; Sgpp1, mouse gene encoding sphingosine-1-phosphate phosphatase; Sgpl1, mouse gene encoding sphingosine-1-phosphate lyase; Asah1, mouse gene encoding acid ceramidase; Asah2, mouse gene encoding neutral/alkaline ceramidase; -P, phosphorylated; WT, wild-type. is a signaling molecule that influences cellular functions including proliferation, survival, migration, adhesion molecule expression, and morphogenesis (1Spiegel S. Milstien S. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 397-407Crossref PubMed Scopus (1791) Google Scholar, 2Kluk M.J. Hla T. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 72-80Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar, 3Goetzl E.J. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001; 64: 11-20Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 4Allende M.L. Proia R.L. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 222-227Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar). S1P binds to members of the S1P receptor family (also known as EDG receptors) and, via G proteins, triggers multiple signaling pathways (5Hla T. Maciag T. J. Biol. Chem. 1990; 265: 9308-9313Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 6Lee M.J. Van Brocklyn J.R. Thangada S. Liu C.H. Hand A.R. Menzeleev R. Spiegel S. Hla T. Science. 1998; 279: 1552-1555Crossref PubMed Scopus (896) Google Scholar). S1P has also been shown to function intracellularly mediating calcium homeostasis, cell growth, and suppression of apoptosis (7Hla T. Lee M.J. Ancellin N. Liu C.H. Thangada S. Thompson B.D. Kluk M. Biochem. Pharmacol. 1999; 58: 201-207Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 8Spiegel S. Milstien S. FEBS Lett. 2000; 476: 55-57Crossref PubMed Scopus (245) Google Scholar). In mammals, vascular development and lymphocyte trafficking are dependent on S1P receptor signaling (9Liu Y. Wada R. Yamashita T. Mi Y. Deng C.X. Hobson J.P. Rosenfeldt H.M. Nava V.E. Chae S.S. Lee M.J. Liu C.H. Hla T. Spiegel S. Proia R.L. J. Clin. Investig. 2000; 106: 951-961Crossref PubMed Scopus (1009) Google Scholar, 10Allende M.L. Yamashita T. Proia R.L. Blood. 2003; 102: 3665-3667Crossref PubMed Scopus (322) Google Scholar, 11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar, 13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar). Sphingosine kinase (SPHK) catalyzes the synthesis of S1P via the phosphorylation of sphingosine. SPHK activity is elevated by several stimuli, including platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor, tumor necrosis factor-α, and phorbol ester, which trigger an increase in cellular S1P levels (14Olivera A. Spiegel S. Prostaglandins. 2001; 64: 123-134Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar). Sphk genes have been identified in mammals (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar, 16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar, 17Nava V.E. Lacana E. Poulton S. Liu H. Sugiura M. Kono K. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. FEBS Lett. 2000; 473: 81-84Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar, 18Melendez A.J. Carlos-Dias E. Gosink M. Allen J.M. Takacs L. Gene (Amst.). 2000; 251: 19-26Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar), insects (19Herr D.R. Fyrst H. Creason M.B. Phan V.H. Saba J.D. Harris G.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 12685-12694Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (46) Google Scholar), plants (20Nishiura H. Tamura K. Morimoto Y. Imai H. Biochem. Soc. Trans. 2000; 28: 747-748Crossref PubMed Google Scholar), yeast (21Nagiec M.M. Skrzypek M. Nagiec E.E. Lester R.L. Dickson R.C. J. Biol. Chem. 1998; 273: 19437-19442Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (145) Google Scholar), worm (22Mendel J. Heinecke K. Fyrst H. Saba J.D. J. Biol. Chem. 2003; 278: 22341-22349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (63) Google Scholar), and slime mold (23Morio T. Urushihara H. Saito T. Ugawa Y. Mizuno H. Yoshida M. Yoshino R. Mitra B.N. Pi M. Sato T. Takemoto K. Yasukawa H. Williams J. Maeda M. Takeuchi I. Ochiai H. Tanaka Y. DNA Res. 1998; 5: 335-340Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar, 24Li G. Foote C. Alexander S. Alexander H. Development. 2001; 128: 3473-3483PubMed Google Scholar). Mammals carry two known SphK genes, which in mice are encoded by Sphk1 and Sphk2. The two enzymes contain five highly conserved regions (C1–C5) and an ATP binding site within a conserved lipid kinase catalytic domain (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar, 16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar). SPHK1 has a predominantly cytoplasm localization but can be induced to localize to the inner leaflet of the plasma membrane. Interestingly in endothelial cells SPHK1 is secreted and is capable of producing S1P extracellularly (25Ancellin N. Colmont C. Su J. Li Q. Mittereder N. Chae S.S. Stefansson S. Liau G. Hla T. J. Biol. Chem. 2002; 277: 6667-6675Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (256) Google Scholar). Sphk1 shows a tissue distribution and developmental expression pattern different from Sphk2, although both enzymes are widely expressed (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar, 26Fukuda Y. Kihara A. Igarashi Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 309: 155-160Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar). The importance of S1P receptor signaling in lymphocyte trafficking was first illuminated by the activities of FTY720, a potent immunosuppressive agent. FTY720 is a sphingosine analogue that, when phosphorylated, functions as an agonist for four of the five S1P receptors (S1P1, S1P3, S1P4, and S1P5 but not S1P2) (13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar, 27Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1343) Google Scholar). FTY720-P causes lymphopenia through sequestration of circulating lymphocytes within lymph nodes and Peyer's patches and also blocks the exit of T-cells from thymus (13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar, 27Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1343) Google Scholar, 28Chiba K. Yanagawa Y. Masubuchi Y. Kataoka H. Kawaguchi T. Ohtsuki M. Hoshino Y. J. Immunol. 1998; 160: 5037-5044PubMed Google Scholar, 29Yagi H. Kamba R. Chiba K. Soga H. Yaguchi K. Nakamura M. Itoh T. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 1435-1444Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar, 30Rosen H. Alfonso C. Surh C.D. McHeyzer-Williams M.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 10907-10912Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar). Deletion of the S1P1 receptor on thymocytes blocks egress of mature T-cells from thymus and, thus, their presence in the periphery (11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). Similarly T-cell trafficking out of lymph nodes has been shown to depend on the presence of the S1P1 receptor on T-cells (12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). In both cases, the S1P1 receptor may function to direct migration toward high levels of S1P found in circulating fluids. Since FTY720 treatment phenocopies the physiology produced by the deletion of S1P1 in lymphocytes, FTY720 may exert its effects through the interaction with the S1P1 receptor on lymphocytes with subsequent receptor inactivation. Indeed it has been shown that FTY720 may induce receptor internalization and subsequent degradation (31Graler M.H. Goetzl E.J. FASEB J. 2004; 18: 551-553Crossref PubMed Scopus (467) Google Scholar). FTY720 can be phosphorylated by both SPHK1 and SPHK2 in vitro (32Sanchez T. Estrada-Hernandez T. Paik J.H. Wu M.T. Venkataraman K. Brinkmann V. Claffey K. Hla T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47281-47290Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (356) Google Scholar, 33Paugh S.W. Payne S.G. Barbour S.E. Milstien S. Spiegel S. FEBS Lett. 2003; 554: 189-193Crossref PubMed Scopus (276) Google Scholar, 34Billich A. Bornancin F. Devay P. Mechtcheriakova D. Urtz N. Baumruker T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47408-47415Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (403) Google Scholar), although the relevant in vivo kinase has not been identified. We generated mice with a null Sphk1 gene to study the physiological functions of SPHK1 and its role in S1P generation. We also utilized these mice to examine the metabolism and activity of FTY720 in vivo. Our results demonstrate that FTY720 phosphorylation was decreased in the Sphk1 null mice, although sufficient levels of FTY720-P were generated to achieve full lymphopenia. Generation of Sphk1 Null Mice—To generate the Sphk1 null mice, we cloned a genomic DNA fragment containing the Sphk1 gene from a 129/sv strain library. A 3-kb fragment containing exon 1 and exon 2 and a 7-kb fragment XhoI/NotI that included part of exon 6 together with neomycin and thymidine kinase expression cassettes were used to prepare the targeting vector. The targeting vector was introduced into TC1 embryonic stem cells by electroporation, and the resulting clones were screened by Southern blotting. Targeted embryonic stem cells lines were injected into C57BL/6 blastocysts, and the chimeric male mice that were obtained were bred to C57BL/6 females. The agouti offspring were tested for transmission of the disrupted allele by Southern blot analysis. Heterozygous matings were set up to generate homozygous mutant mice. Mice (Sphk1-/- and littermate controls Sphk1+/- and Sphk1+/+ maintained on 129/sv × C57BL6 mixed background) were genotyped by Southern blotting using the probe shown on Fig. 1 and by PCR from tail biopsies. The primer sequences for the PCR were as follows: primer 1, 5′-TGTCACCCATGAACCTGCTGTCCCTGCACA; primer 2, 5′-AGAAGGCACTGGCTCCTCCAGAGGAACAAG; primer neo, 5′-TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT (94 °C for 1 min, 65 °C for 1 min, and 72 °C for 1 min). The wild-type allele yielded a DNA fragment of about 300 bp, and the targeted allele yielded a fragment of ∼350 bp. SPHK Determinations—SPHK activity was measured essentially as described previously (35Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (204) Google Scholar). Tissue homogenates (5–20 μg of protein in sphingosine kinase buffer: 50 mm Tris (pH 7.5), 10% glycerol, 1 mm β-mercaptoethanol, 1 mm EDTA, 1 mm sodium orthovanadate, 40 mm β-glycerophosphate, 15 mm NaF, 10 μg/ml leupeptin and aprotinin, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, and 0.5 mm 4-deoxypyridoxine) were incubated with 50 μm sphingosine (prepared either in mixed micelles with Triton X-100 or in bovine serum albumin complexes without Triton X-100), 10 μCi of [γ-32P]ATP (1 mm), and 10 mmMgCl2. Labeled lipids were extracted and resolved by TLC as described previously (35Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (204) Google Scholar, 36Zhang H. Desai N.N. Olivera A. Seki T. Brooker G. Spiegel S. J. Cell Biol. 1991; 114: 155-167Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar). Labeled S1P was quantified with a PhosphorImager. For phosphorylation of sphingosine by cultured mouse embryonic fibroblasts, the cells, prepared as described previously (37Kluk M.J. Colmont C. Wu M.T. Hla T. FEBS Lett. 2003; 533: 25-28Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), were washed with phosphate-free Dulbecco's modified Eagle's medium and subsequently incubated with this medium containing 32Pi (40 μCi/ml) for 24 h as described previously (36Zhang H. Desai N.N. Olivera A. Seki T. Brooker G. Spiegel S. J. Cell Biol. 1991; 114: 155-167Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar). The cells were then incubated with 10 μm sphingosine or vehicle (controls) for 1 h, and S1P was extracted from the cells (38Yatomi Y. Ruan F. Ohta J. Welch R.J. Hakomori S. Igarashi Y. Anal. Biochem. 1995; 230: 315-320Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar, 39van Echten-Deckert G. Zschoche A. Bar T. Schmidt R.R. Raths A. Heinemann T. Sandhoff K. J. Biol. Chem. 1997; 272: 15825-15833Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (70) Google Scholar). S1P was resolved by TLC in 1-butanol:methanol: acetic acid:water (80:20:10:20 by volume), visualized by autoradiography, and identified by RF value. Quantitative evaluation was performed using the Fujifilm Bas 1000 imager and TINA 2.09 software (Raytest, Straubenhardt, Germany). Platelet Preparation—Platelets were isolated from whole blood of Sphk1-/- and WT mice as described previously (40Krueger L.A. Barnard M.R. Frelinger A.L. II I Furman M.I. Michelson A.D. Coligan J.E. Kruisbeek A.M. Margulies D.H. Shevach E.M. Strober W. Current Protocols in Cytometry. John Wiley & Sons, Inc., New York2002: 6.10.1-16.10.17Google Scholar). Blood was collected in 110 volume of acid citrate dextrose as anticoagulant and centrifuged for 10 min at 150 × g at room temperature. The resulting platelet-rich plasma was diluted with citrate wash buffer (11 mm glucose, 128 mm NaCl, 4.3 mm NaH2PO4, 7.5 mm Na2HPO4, 4.8 mm sodium citrate, and 2.4 mm citric acid, pH 6.5) and centrifuged for 10 min at 1,200 × g at room temperature. Cells were washed with citrate wash buffer, resuspended in sphingosine kinase buffer, and homogenized. Total cell homogenates were used for the sphingosine kinase assay. mRNA Expression Measurement—For real time PCR, total RNA was purified using TRIzol (Invitrogen). Mouse Sphk1, Sphk2, Sgpp1, Sgpl1, Asah1, and Asah2 mRNAs were quantified using Assays-on-demand (Applied Biosystems, Foster City, CA) with an ABI Prism 7700 sequence detection system (Applied Biosystems). Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA was detected as an internal standard. Measurement of S1P Levels—Lipids from tissue homogenates or serum were extracted with 1 ml of chloroform:25 mm HCl, methanol (1:1) plus 100 μl of 3 n NaOH. Organic phases were back-washed with 1 ml of 25 mm HCl, methanol and 1 ml of 1 m NaCl plus 100 μl of 3 n NaOH. Mass levels of S1P in the pooled aqueous phases were determined exactly as described previously (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar). Pathology and Lymphocyte Analysis—A pathologic evaluation of Sphk1-/- mice was performed by the National Institutes of Health Division of Veterinary Resources Pathology Service. This included histologic evaluation of organ systems and analysis of hematology and blood chemistries. Lymphocytes from thymus, spleen, peripheral lymph nodes (lingual, axillary, branchial, and inguinal), mesenteric lymph nodes, and Peyer's patches from 6–10-week-old mice were isolated and analyzed by flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences) using phycoerythrin-labeled anti-CD3ϵ and phycoerythrin-Cy5-labeled anti-B220 (BD Bioscience). Blood (25 μl) was mixed with an equal volume of phosphate-buffered saline containing 5% rat serum, 5 mm EDTA, and the following rat anti-mouse direct conjugated fluorescent antibody stains (BD Biosciences): Ly6G-fluorescein isothiocyanate, CD3-phycoerythrin, CD45-peridinin chlorophyll protein-Cy5.5, and B220-allophycocyanin. After standing for 15 min at room temperature in the dark, 0.5 ml of ACK lysing buffer (BIOSOURCE) was added containing 3.0 × 104/ml non-fluorescent, 10-μm polystyrene beads (Polysciences). Samples were vortexed and analyzed by flow cytometry within 30 min. Singlet beads were enumerated from forward-side scatter plots, and quantitative cell populations were determined by their cell:bead ratio. Total lymphocytes were gated and scored as CD45+Ly6G-. T- and B-cell subsets, CD3+ and B220+, respectively, were determined from within the lymphocytegated population. FTY720 Treatment—Mice (Sphk1-/- and their Sphk1+/+ littermates) were dosed intravenously with FTY720 at 0.3 mg/kg or 3 mg/kg or with an equivalent volume of vehicle, 2% (w/v) hydroxypropyl-β- cyclodextrin. Blood was collected by direct cardiac puncture upon CO2 euthanasia. Groups of six mice were evaluated by liquid chromatography-mass spectrometry for plasma levels of FTY720, FTY720-P, and S1P at 4 h postdose. Flow cytometry analysis was performed on blood samples from subgroups of three. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry—Plasma levels of FTY720, FTY720-P, and S1P were determined by high performance liquid chromatography with detection by electrospray tandem mass spectroscopy (LCQ-DECA, ThermoFinnigan). Solid phase extraction of samples (plasma diluted 1:20 in 0.5% formic acid, 10% tetrahydrofuran, 5% butanol, and internal standard 0.05 μg/ml C17-S1P, Avanti Polar Lipids) was accomplished by column switching. 100 μl was injected onto a clean-up column (hand packed pellicular phenyl (Alltech), 2.0 × 23 mm) equilibrated with 0.5% formic acid. After 2 min of 0.6 ml/min flow, the clean-up column was switched in-line with the analytical column (Luna phenylhexyl, 4.0 × 50 mm (Phenomenex)), and the compounds were eluted with an acetonitrile gradient. Generation of Sphk1 Knock-out Mice—The mouse Sphk1 gene is composed of six exons and five introns (Fig. 1A). To knock out Sphk1 expression in mice, a gene-targeting vector was prepared in which the region containing exons 3, 4, and 5 and the 5′-end of exon 6 was replaced by a neomycin-resistant gene cassette (Fig. 1A). These deleted exons correspond to the putative lipid kinase catalytic domain, which includes the conserved domains C1, C2, C3, and part of C4 and a putative nucleotide binding motif (15Kohama T. Olivera A. Edsall L. Nagiec M.M. Dickson R. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23722-23728Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (478) Google Scholar, 41Pitson S.M. Moretti P.A. Zebol J.R. Zareie R. Derian C.K. Darrow A.L. Qi J. D'Andrea R.J. Bagley C.J. Vadas M.A. Wattenberg B.W. J. Biol. Chem. 2002; 277: 49545-49553Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar). Sphk1 gene-targeted embryonic stem cells were isolated and used to produce chimeric male mice, which passed on the targeted allele to their offspring. By intercrossing heterozygous mutant mice, viable homozygous Sphk1 mutant mice were obtained in the expected Mendelian ratio indicating an absence of embryonic lethality. The correct targeting of the Sphk1 locus was confirmed by Southern blotting (Fig. 1B). SacI digestion of genomic DNA and hybridization with a probe external to the region contained within the targeting vector yielded a 7-kb band corresponding to the WT allele and the predicted 5.5-kb band corresponding to the targeted allele. The homozygous Sphk1 mutant mice were fertile and lived longer than 1 year. A histologic evaluation of major organs from the Sphk1 mutant mice indicated that no abnormal pathology was present. To determine whether Sphk1 expression was abolished by the targeting procedure, we performed Northern blotting using RNA from kidney, the original tissue source for the purification of SPHK1 enzyme (35Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (204) Google Scholar). An Sphk1 transcript was detected in samples from WT and heterozygote mice but not from homozygous mutant mice (Fig. 1C). To verify this result, we also performed reverse transcription-PCR using kidney RNA. No Sphk1 transcript was detected in the Sphk1-/- sample (Fig. 1D). Quantitative real time PCR was performed to measure Sphk1 and Sphk2 mRNA expression in brain and kidney from the Sphk1-/- mice (Fig. 2A). Sphk1 mRNA was undetectable in the tissues. These results confirmed that the targeting of Sphk1 resulted in a null allele. Sphk2 mRNA levels were not altered in the Sphk1-/- mice relative to WT levels (Fig. 2A). Also we measured mRNA expression of other genes that could be involved in the S1P biosynthetic pathway (1Spiegel S. Milstien S. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 397-407Crossref PubMed Scopus (1791) Google Scholar). mRNA levels for Sgpp1, Sgpl1, Asah1, and Asah2 were not affected in the Sphk1 null brain and kidney (Fig. 2A). Sphingosine Kinase and S1P Levels in Tissues—We next determined SPHK activity and the levels of S1P in tissues from WT and Sphk1 null mice. Enzyme assays were performed in the presence (Fig. 2B) and absence (Fig. 2C) of Triton X-100 since this detergent has been reported to stimulate SPHK1 activity and to inhibit SPHK2 activity (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar). In both assays, total SPHK activity was substantially decreased relative to WT in most Sphk1 null tissues (Fig. 2, A and B), although the differences were greater when the assay was performed in the presence of Triton X-100. Lymphoid tissue, in particular, showed a large diminution in activity with a >90% reduction of SPHK activity in spleen (Fig. 2, B and C). Interestingly SPHK activity in platelets from Sphk1 null mice was not statistically different from that of WT mice (Fig. 2, B and C). In contrast, S1P levels in most Sphk1 null tissues were similar or slightly decreased when compared with WT (Fig. 2D). An exception was serum, which normally contains relatively high levels of S1P (42Yatomi Y. Igarashi Y. Yang L. Hisano N. Qi R. Asazuma N. Satoh K. Ozaki Y. Kume S. J. Biochem. (Tokyo). 1997; 121: 969-973Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar). Here a substantial reduction of greater than 50% was observed in the Sphk1 null mice compared with WT (Fig. 2D, inset). Mouse embryonic fibroblasts from Sphk1 null mice contained less than 10% of the SPHK activity detected in WT fibroblasts (Fig. 3A). The capacity of the fibroblasts to synthesize S1P was determined after incubation with sphingosine and 32Pi. Although both WT and Sphk1 null fibroblasts phosphorylated sphingosine to form S1P, the amount of product was about 70% lower in cells from Sphk1 null mice (Fig. 3B). FTY720 Is Phosphorylated and Causes Lymphopenia in Sphk1 Null Mice—Signaling through the S1P1 receptor is required for the exit of lymphocytes from thymus and lymph nodes (11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). We analyzed the total number of lymphocytes and percentages of T- and B-cells in thymus and secondary lymph organs to determine whether lymphocyte distribution was affected in Sphk1 null mice. No significant differences were observed in cellularity or in T-cell or B-cell percentages in thymus, spleen, peripheral and mesenteric lymph nodes, Peyer's patches (Table I), or blood (Fig. 4, A and B) from Sphk1 null mice compared with control WT.Table IComparison of absolute lymphocyte numbers and percentages of T- and B-cells between Sphk1 +/+ and Sphk1 -/- mice The total number of cells was determined by counting isolated cells using a Coulter counter. The percentages of T- and B-lymphocytes were calculated by flow cytometry using phycoerythrin-conjugated CD3ϵ and fluorescein isothiocyanate-conjugated B220 antibodies, respectively. Values represent means ± S.D., n = 4 for total cell numbers and thymus and spleen determinations, n = 3 for peripheral lymph node and n = 2 for mesenteric lymph node and Peyer's patch determinations. PLN, peripheral lymph nodes; MLN, mesenteric lymph nodes; PP, Peyer's patches.TissueTotal cells (×106)Percentage of T-lymphocytesPercentage of B-lymphocytesSphk1 +/+Sphk1 -/-Sphk1 +/+Sphk1 -/-Sphk1 +/+Sphk1 -/-%%Thymus21 ± 724 ± 389 ± 788 ± 6Spleen25 ± 627 ± 643 ± 944 ± 343 ± 1144 ± 6PLN6 ± 25 ± 167 ± 1660 ± 831 ± 532 ± 4MLN4 ± 12 ± 163 ± 365 ± 228 ± 325 ± 6PP3 ± 13 ± 1 Open table in a new tab Intravenous administration of FTY720 was equally effective in reducing blood lymphocytes in both Sphk1 null and WT mice even at the lower dose used (Fig. 4, A and B). At 3 mg/kg FYT720, total lymphocyte numbers were reduced an average of 64% (p < 0.05) with T-cells lowered by 85% (p < 0.01) and B-cells lowered by 53% (p < 0.05). When 0.3 mg/kg FTY720 was used, the total lymphocyte numbers decreased about 78% (p < 0.01), the T-cell numbers decreased 92% (p < 0.01), and B-cell numbers decreased 77% (p < 0.01). Phosphorylation of FTY720 is required for altering lymphocyte trafficking (13Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1466) Google Scholar, 27Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1343) Google Scholar), and liquid chromatography-mass spectrometry analysis revealed the presence of phosphorylated FTY720 (FTY720-P) (Fig. 4, C and D) in the two groups at both doses analyzed. FTY720-P levels in Sphk1 null mice treated with 3 mg/kg and 0.3 mg/kg FYT720 were 41% (p < 0.05) and 24% (p < 0.12) lower, respectively, than in WT. In both cases, absolute levels of FTY720-P were sufficient to have achieved full lymphopenia (Fig. 4). Plasma S1P was reduced 65% (p < 0.001) in Sphk1 null mice. At the doses used in this study, FTY720 appeared not to alter circulating plasma S1P levels in WT (Fig. 4, C and D). The lower S1P levels in plasma relative to serum (Fig. 2D, inset) are consistent with S1P release by platelets during blood clotting (42Yatomi Y. Igarashi Y. Yang L. Hisano N. Qi R. Asazuma N. Satoh K. Ozaki Y. Kume S. J. Biochem. (Tokyo). 1997; 121: 969-973Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 43English D. Welch Z. Kovala A.T. Harvey K. Volpert O.V. Brindley D.N. Garcia J.G. FASEB J. 2000; 14: 2255-2265Crossref PubMed Scopus (266) Google Scholar). This is the first report of a knock-out for a sphingosine kinase gene in mammals. Mice null for the Sphk1 gene are viable and are, thus, distinct from S1P1 receptor null mice, which die in utero due to a block in vascular system development (9Liu Y. Wada R. Yamashita T. Mi Y. Deng C.X. Hobson J.P. Rosenfeldt H.M. Nava V.E. Chae S.S. Lee M.J. Liu C.H. Hla T. Spiegel S. Proia R.L. J. Clin. Investig. 2000; 106: 951-961Crossref PubMed Scopus (1009) Google Scholar). The strikingly different phenotype between these two knock-out mice indicates that S1P signaling was not abolished in Sphk1 null mice. Indeed, with the deletion of the Sphk1 gene, SPHK catalytic activity was substantially but not completely reduced in most tissues. The remaining SPHK activity in Sphk1 null tissues was likely to be contributed, at least in part, by SPHK2, which has been found to be widely distributed among mouse tissues (16Liu H. Sugiura M. Nava V.E. Edsall L.C. Kono K. Poulton S. Milstien S. Kohama T. Spiegel S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 19513-19520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (571) Google Scholar, 26Fukuda Y. Kihara A. Igarashi Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 309: 155-160Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar). Additional SPHKs are possible, but others have not been identified. Although our results indicate that the Sphk1 gene contributes the major SPHK activity in most of the tissues analyzed, levels of the product, S1P, were not substantially reduced in the corresponding Sphk1 null tissues. This may reflect compensatory mechanisms to maintain critical cellular S1P levels and likely explains the lack of a severe phenotype. In addition to SPHK2 and possibly other kinases, autotaxin (lysophospho-lipase D) may also be a source of extracellular S1P generation via hydrolysis of sphingosylphosphorylcholine (44Umezu-Goto M. Kishi Y. Taira A. Hama K. Dohmae N. Takio K. Yamori T. Mills G.B. Inoue K. Aoki J. Arai H. J. Cell Biol. 2002; 158: 227-233Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar, 45Clair T. Aoki J. Koh E. Bandle R.W. Nam S.W. Ptaszynska M.M. Mills G.B. Schiffmann E. Liotta L.A. Stracke M.L. Cancer Res. 2003; 63: 5446-5453PubMed Google Scholar). Also changes in the activities of S1P lyase, S1P phosphatase, or ceramidases might contribute to the maintenance of the S1P levels in Sphk1 null mice. However, no changes in mRNA expression of these genes, Sgpp1, Sgpl1, Asah1, and Asah2, were detected after Sphk1 deletion. Serum and plasma levels of S1P in the Sphk1 null mice were reduced to less than 50% of WT, indicating that SPHK1 has an important but not an exclusive role in regulating serum levels of S1P. Even with this reduction in the Sphk1 null mice, the absolute S1P levels in serum and plasma were in the micromolar range, although the actual amount of S1P that is bioavailable is not known. Our determinations of plasma and serum S1P concentrations in mouse are higher than the reported human levels (42Yatomi Y. Igarashi Y. Yang L. Hisano N. Qi R. Asazuma N. Satoh K. Ozaki Y. Kume S. J. Biochem. (Tokyo). 1997; 121: 969-973Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 46Yatomi Y. Ozaki Y. Ohmori T. Igarashi Y. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001; 64: 107-122Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar). The lymphocyte S1P1 receptor controls egress of mature thymocytes from the thymus and of lymphocytes from lymph nodes (11Allende M.L. Dreier J.L. Mandala S. Proia R.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 15396-15401Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 12Matloubian M. Lo C.G. Cinamon G. Lesneski M.J. Xu Y. Brinkmann V. Allende M.L. Proia R.L. Cyster J.G. Nature. 2004; 427: 355-360Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar). Circulating levels of S1P, which could act on the S1P1 receptor as a migratory signal, may be key to these trafficking events. We did not find alterations in cellularity of lymphoid organs or in distribution of T- and B-cells between lymphoid compartments. These results indicate that if circulating levels of S1P are critical for lymphocyte trafficking, the lowered levels in serum and plasma in the Sphk1 null mice are sufficient to maintain this process. Previous in vitro studies have demonstrated that the sphingosine analogue FTY720 can be a substrate for both SPHK1 and SPHK2 (32Sanchez T. Estrada-Hernandez T. Paik J.H. Wu M.T. Venkataraman K. Brinkmann V. Claffey K. Hla T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47281-47290Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (356) Google Scholar, 33Paugh S.W. Payne S.G. Barbour S.E. Milstien S. Spiegel S. FEBS Lett. 2003; 554: 189-193Crossref PubMed Scopus (276) Google Scholar, 34Billich A. Bornancin F. Devay P. Mechtcheriakova D. Urtz N. Baumruker T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47408-47415Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (403) Google Scholar). Although some studies had indicated that SPHK2 was more efficient than SPHK1 in catalyzing FTY720 phosphorylation, the enzyme responsible for the in vivo modification of FTY720 was not known. Factors such as accessibility of the substrate to cellular compartments and tissue distribution of the enzymes could influence FTY720 phosphorylation. In the Sphk1 null mice, administered FTY720 was converted to FTY720-P about 25–40% less efficiently than in WT mice, depending of the dose used. The reduction of FTY720-P production in Sphk1 null mice may indicate that SPHK1 normally acts on FTY720 in vivo or may be due to an adaptive shift in equilibrium of competing substrate pools in Sphk1 null mice. However, sufficient levels of FTY720-P were reached in the Sphk1 null mice to generate lymphopenia. These results demonstrate that SPHK1 is dispensable for the functional expression of an immunosuppressive response to FTY720. Although we cannot rule out possible contributions by other unknown kinase activities, these results are consistent with the conclusion that SPHK2 is sufficient for FTY720 functional activation in vivo. In summary, we have reported the first genetic deletion of Sphk1 in mice. Although S1P receptor signaling is essential for lymphocyte trafficking and development of the vascular system in mice, there was no evidence that Sphk1 null mice have major abnormalities in these processes. Severe disruption of physiologic S1P signaling is likely to require substantially reducing circulating and tissue levels of S1P by the simultaneous deletion of multiple Sphk genes. Finally the Sphk1 null mice will be valuable for exploring the role of SPHK1 in vascular function, cancer, autoimmunity, and infertility (47Hla T. Semin. Cell Dev. Biol. 2004; 15: 513-520Crossref PubMed Scopus (353) Google Scholar). We thank Andrea Raths for excellent technical assistance.

S1P1 is a widely distributed G protein-coupled receptor whose ligand, sphingosine 1-phosphate, is present in high concentrations in the blood. The sphingosine 1-phosphate receptor-signaling pathway is believed to have potent effects on cell trafficking in the immune system. To determine the precise role of the S1P1 receptor on T-cells, we established a T-cell-specific S1P1 knock-out mouse. The mutant mice showed a block in the egress of mature T-cells into the periphery. The expression of the S1P1 receptor was up-regulated in mature thymocytes, and its deletion altered the chemotactic responses of thymocytes to sphingosine 1-phosphate. The results indicated that the expression of the S1P1 receptor on T-cells controls their exit from the thymus and entry into the blood and, thus, has a central role in regulating the numbers of peripheral T-cells. S1P1 is a widely distributed G protein-coupled receptor whose ligand, sphingosine 1-phosphate, is present in high concentrations in the blood. The sphingosine 1-phosphate receptor-signaling pathway is believed to have potent effects on cell trafficking in the immune system. To determine the precise role of the S1P1 receptor on T-cells, we established a T-cell-specific S1P1 knock-out mouse. The mutant mice showed a block in the egress of mature T-cells into the periphery. The expression of the S1P1 receptor was up-regulated in mature thymocytes, and its deletion altered the chemotactic responses of thymocytes to sphingosine 1-phosphate. The results indicated that the expression of the S1P1 receptor on T-cells controls their exit from the thymus and entry into the blood and, thus, has a central role in regulating the numbers of peripheral T-cells. Sphingolipids are important signaling molecules in a variety of biologic contexts (1Merrill Jr., A.H. Schmelz E.M. Dillehay D.L. Spiegel S. Shayman J.A. Schroeder J.J. Riley R.T. Voss K.A. Wang E. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1997; 142: 208-225Crossref PubMed Scopus (567) Google Scholar, 2Shayman J.A. Kidney Int. 2000; 58: 11-26Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (52) Google Scholar, 3Hakomori S. Curr. Opin. Hematol. 2003; 10: 16-24Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar). Sphingosine 1-phosphate, in one paradigm, binds to members of a family of G protein-coupled receptors (S1P1-15) triggering diverse effects including proliferation, survival, migration, morphogenesis, adhesion molecule expression, and cytoskeletal changes (4Fukushima N. Ishii I. Contos J.J. Weiner J.A. Chun J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001; 41: 507-534Crossref PubMed Scopus (323) Google Scholar, 5Goetzl E.J. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001; 64: 11-20Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 6Allende M.L. Proia R.L. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 222-227Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar, 7Kluk M.J. Hla T. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 72-80Crossref PubMed Scopus (279) Google Scholar, 8Spiegel S. Milstien S. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 397-407Crossref PubMed Scopus (1758) Google Scholar). S1P1/Edg1, the first of these receptors described (9Hla T. Maciag T. J. Biol. Chem. 1990; 265: 9308-9313Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 10Lee M.J. Van Brocklyn J.R. Thangada S. Liu C.H. Hand A.R. Menzeleev R. Spiegel S. Hla T. Science. 1998; 279: 1552-1555Crossref PubMed Scopus (889) Google Scholar), couples to a Gi pathway. During embryonic development, the S1P1 receptor is highly expressed in the vascular system. Gene disruption in mice has demonstrated an essential function of the S1P1 receptor in endothelial cells for the formation of a stable vascular network (11Liu Y. Wada R. Yamashita T. Mi Y. Deng C.X. Hobson J.P. Rosenfeldt H.M. Nava V.E. Chae S.S. Lee M.J. Liu C.H. Hla T. Spiegel S. Proia R.L. J. Clin. Investig. 2000; 106: 951-961Crossref PubMed Scopus (993) Google Scholar, 12Allende M.L. Yamashita T. Proia R.L. Blood. 2003; 102: 3665-3667Crossref PubMed Scopus (316) Google Scholar). The S1P1 receptor is widely expressed in the adult, in particular in endothelial cells, the brain, and the heart, and also in the cells of the immune system (13Zhang G. Contos J.J. Weiner J.A. Fukushima N. Chun J. Gene (Amst.). 1999; 227: 89-99Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 14An S. Goetzl E.J. Lee H. J. Cell. Biochem. 1998; 30-31 (suppl.): 147-157Crossref Google Scholar). S1P1 and S1P4 receptors have been detected in T-lymphocytes (15Graler M.H. Bernhardt G. Lipp M. Genomics. 1998; 53: 164-169Crossref PubMed Scopus (210) Google Scholar, 16Graeler M. Goetzl E.J. FASEB J. 2002; 16: 1874-1878Crossref PubMed Scopus (192) Google Scholar, 17Graeler M. Shankar G. Goetzl E.J. J. Immunol. 2002; 169: 4084-4087Crossref PubMed Scopus (110) Google Scholar). Stimulation of receptor signaling has been found to mediate and regulate cell migration and suppress proliferation and cytokine production (17Graeler M. Shankar G. Goetzl E.J. J. Immunol. 2002; 169: 4084-4087Crossref PubMed Scopus (110) Google Scholar, 18Dorsam G. Graeler M.H. Seroogy C. Kong Y. Voice J.K. Goetzl E.J. J. Immunol. 2003; 171: 3500-3507Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). Recently, S1P 1The abbreviations used are: S1P, sphingosine 1-phosphate; TCS1P1KO, S1P1loxP/loxP mice carrying the Lck-Cre gene; BSA, bovine serum albumin; PE, phycoerythrin; FITC, fluorescein isothiocyanate; SP, single positive. receptors have also been implicated in lymphocyte trafficking and homing as the result of studies using FTY720, a potent immunosuppressive agent. FTY720, a sphingosine analogue, is phosphorylated by sphingosine kinase type I and more efficiently by sphingosine kinase type II (19Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1314) Google Scholar, 20Billich A. Bornancin F. Devay P. Mechtcheriakova D. Urtz N. Baumruker T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47408-47415Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (395) Google Scholar, 21Sanchez T. Estrada-Hernandez T. Paik J.H. Wu M.T. Venkataraman K. Brinkmann V. Claffey K. Hla T. J. Biol. Chem. 2003; 278: 47281-47290Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (349) Google Scholar) and functions as an agonist ligand for S1P1, S1P3, S1P4, and S1P5 receptors (19Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1314) Google Scholar, 22Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1435) Google Scholar). FTY720 causes lymphopenia through sequestration of circulating lymphocytes within lymph nodes and Peyer's patches (19Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1314) Google Scholar, 22Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1435) Google Scholar, 23Chiba K. Yanagawa Y. Masubuchi Y. Kataoka H. Kawaguchi T. Ohtsuki M. Hoshino Y. J. Immunol. 1998; 160: 5037-5044PubMed Google Scholar, 24Brinkmann V. Pinschewer D. Chiba K. Feng L. Trends Pharmacol. Sci. 2000; 21: 49-52Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (148) Google Scholar) and also blocks the egress of T-cells from the thymus (25Yagi H. Kamba R. Chiba K. Soga H. Yaguchi K. Nakamura M. Itoh T. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 1435-1444Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 26Rosen H. Alfonso C. Surh C.D. McHeyzer-Williams M.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 10907-10912Crossref PubMed Scopus (112) Google Scholar). However, it is not known at which S1P receptor and cell type FTY720 exerts its effects. To begin to address the physiologic function of the S1P1 receptor and sphingosine 1-phosphate signaling in T-cells, we have generated a T-cell-specific mouse knock-out of the S1P1 receptor using the Cre/loxP system. Our results with these mice reveal a crucial role for the S1P1 receptor in the egress of mature T-cells from the thymus into the circulation. Generation of the S1P1loxP/loxP Lck-Cre Mice—We previously generated the S1P1loxP/loxP mice (12Allende M.L. Yamashita T. Proia R.L. Blood. 2003; 102: 3665-3667Crossref PubMed Scopus (316) Google Scholar) carrying the S1P1 gene modified by two loxP sequences flanking exon 2. To specifically delete the S1P1 receptor from T-cells, S1P1loxP/loxP mice were bred with an Lck-driven Cre transgenic mouse strain, provided by Dr. J. D. Marth (27Orban P.C. Chui D. Marth J.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 6861-6865Crossref PubMed Scopus (510) Google Scholar). S1P1loxP/loxP mice carrying the Lck-Cre gene (TCS1P1KO) and littermate S1P1loxP/loxP mice (controls) were genotyped by PCR using Lck-Cre-specific primers: lck1 on the lck-proximal promoter, 5′CCTCCTGTGAACTTGGTGCTTGAG; lck2 on the Cre coding region, 5′TGCATCGACCGGTAATGCAG. To identify the S1P1 wild type (S1P1WT) and floxed alleles (S1P1loxP) by PCR, the following primers were used: P1, 5′GAGCGGAGGAAGTTAAAAGTG; P2, 5′CCTCCTAAGAGATTGCAGCAA. P1 and P2 amplify an approximately 250-bp fragment for the S1P1loxP allele and a 200-bp fragment for the S1P1WT allele. Lymphocyte Analysis—T-cells were purified from 6-8-week-old thymi and spleens using magnetic beads coated with the anti-CD90.2 antibody (Dynal, Lake Success, NY) according to the manufacturer's instructions. B-cells were purified using MACS B220 microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Whole blood counts were determined in the Department of Laboratory Medicine at the National Institutes of Health. Real-time PCR—Total RNA was purified from T-cells and B-cells using TRIzol (Invitrogen). Mouse S1P1 receptor mRNA was quantified by real time PCR on an ABI Prism 7700 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA). Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase mRNA was used as an internal control. Flow Cytometry—Thymus, spleen, peripheral lymph nodes (lingual, axillary, bronchial, and inguinal), mesenteric lymph nodes, and Peyer's patches from 6-10-week-old mice were dissected and mechanically disaggregated. Single cell suspensions were obtained using a 40-μm cell strainer. Red blood cells were removed by NH4Cl lysis. Cells were diluted in 1% BSA-phosphate-buffered saline and incubated with anti-FcγR antibody (BD Biosciences) to block the binding of conjugated antibodies to FcγR. Cells then were incubated with the proper antibodies on ice for 30 min and then washed and analyzed by flow cytometry using a FACScalibur (BD Biosciences). The antibodies, phycoerythrin (PE)-labeled anti-CD3ϵ, PE-Cy5-labeled anti-CD4, and fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled anti-CD62L were obtained from BD Biosciences. PE-conjugated anti-CD8 antibody was purchased from Beckman Coulter (Fullerton, CA). For S1P1 staining, anti-CD4- and anti-CD8-labeled cells were permeabilized using the Cytofix-Perm kit (BD Biosciences) followed by incubation with a rabbit anti-human S1P1 C-terminal polyclonal antibody, followed by an FITC-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody. As a control, the S1P1 antibody was incubated with a blocking peptide before the addition to the cells. For staining of blood lymphocytes, peripheral blood was collected, red cells were lysed, and cells were stained with FITC-conjugated anti-CD45 (BD Biosciences) and PE-conjugated anti-CD3. Immunohistochemistry—Frozen sections (12 μm) were fixed in cold acetone and stained with specific antibodies followed by fluorescent secondary antibodies and then were visualized. Hamster anti-mouse CD3 and rat anti-mouse B220 were obtained from BD Biosciences. FITC-conjugated anti-hamster IgG and Alexa Fluor 594-conjugated anti-rat IgG (Molecular Probes) were used as secondary antibodies. Intrathymic Labeling of Thymocytes—Thymocytes were labeled as previously described (25Yagi H. Kamba R. Chiba K. Soga H. Yaguchi K. Nakamura M. Itoh T. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 1435-1444Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 28Scollay R.G. Butcher E.C. Weissman I.L. Eur. J. Immunol. 1980; 10: 210-218Crossref PubMed Scopus (490) Google Scholar). Briefly, mice were anesthetized with Avertin (Sigma). The chest cavity was opened and 10 μl of 1 mg/ml FITC in phosphate-buffered saline was injected per thymus lobe. Then, the skin overlying the chest wall was closed using surgical clips. After 20 h, mice were sacrificed to harvest thymus and spleen. Cells were stained for PE-conjugated anti-CD3 antibody and analyzed by flow cytometry. In general, 60-90% of the CD3+ thymocytes were FITC-labeled using this technique. The percentage of recent thymic emigrants in spleens was expressed as the number of CD3+ FITC+ cells per 5 × 105 splenocytes normalized by the fraction of thymocytes labeled in each particular mouse. Chemotaxis Assay—The response of mouse thymocytes toward sphingosine 1-phosphate was studied using 6.5-mm Transwell inserts with a 5-μm pore size (Corning, Cambridge, MA). A thymocyte cell suspension (100 μl at 1 × 107/ml) in RPMI 1640 medium plus 0.4 mg/ml fatty acid-free BSA (Sigma) (medium + fatty acid-free BSA) was added to each insert in a well containing 600 μl of a solution of sphingosine 1-phosphate (Avanti) prepared in medium + fatty acid-free BSA. Wells containing medium + fatty acid-free BSA without sphingosine 1-phosphate were used as controls. After 3 h at 37 °C, cells in the wells were harvested, counted, and analyzed by flow cytometry. Generation and Characterization of T-cell-specific S1P1 Knock-out Mice—To specifically delete the S1P1 receptor in T-cells, S1P1loxP/loxP mice (12Allende M.L. Yamashita T. Proia R.L. Blood. 2003; 102: 3665-3667Crossref PubMed Scopus (316) Google Scholar) were crossed with Lck-Cre transgenic mice (Fig. 1). Lck-Cre transgenic mice express the Cre recombinase under the control of the Lck proximal promoter, which drives the Cre expression specifically in immature thymocytes (27Orban P.C. Chui D. Marth J.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 6861-6865Crossref PubMed Scopus (510) Google Scholar, 29Hennet T. Hagen F.K. Tabak L.A. Marth J.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 12070-12074Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Mice with a T-cell-specific knock-out of the S1P1 receptor (TCS1P1KO mice) appeared normal at birth and as adults and were fertile. A specific and substantial reduction of S1P1 receptor mRNA expression in T-cells of TCS1P1KO mice was confirmed by real time PCR. The S1P1 receptor mRNA expression level in thymocytes of TCS1P1KO mice was found to be reduced by more than 90% (Fig. 2A) compared with control littermates. A reduction of S1P1 receptor mRNA was not seen in B-cells of TCS1P1KO mice (Fig. 2A). In fact, the S1P1 mRNA expression level in splenic B-cells showed a slight increase compared with controls, although the increase was not statistically significant. TCS1P1KO Mice Have Decreased Numbers of T-cell Lymphocytes in Blood and in Peripheral Lymphoid Organs—Peripheral blood cell counts demonstrated a significant reduction of lymphocytes in TCS1P1KO mice (Fig. 2B), whereas the absolute cell numbers of other leukocyte populations were not affected (data not shown). In particular, the percentage of T-cells (CD3+ lymphocytes) in the blood of TCS1P1KO mice was significantly depressed compared with controls (Fig. 2C). As would be expected with the deficiency of T-cells, the percentage of circulating B-cells (B220+ lymphocytes) was increased in the TCS1P1KO mice (percentage of circulating B220+ lymphocytes in control mice, 34 + 8; in TCS1P1KO mice, 61 + 18; n = 4). Spleens from the TCS1P1KO mice had a significantly decreased percentage of CD3+ cells (Fig. 2D) as well as CD4+ and CD8+ cells (data not shown) compared with spleens from control mice. Immunostaining of sections from adult spleens revealed substantially fewer T-cells in the follicles and in the red pulp (Fig. 3, A-D) in TCS1P1KO mice. B-cells found in the follicles and marginal zone appeared to be unaffected in spleens from TCS1P1KO mice (Fig. 3, A-D). Compared with controls, the TCS1P1KO mice exhibited a significant reduction in the number of CD3+ cells in peripheral lymph nodes and a still lesser reduction of CD3+ cells in the mesenteric lymph nodes (Fig. 2D). A slight reduction was observed in Peyer's patches in TCS1P1KO mice although it was not statistically significant (Fig. 2D). Sections of peripheral lymph nodes from TCS1P1KO mice showed that the follicles contained greatly decreased numbers of T-cells (Fig. 3, E and F), whereas B-cells appeared unaffected. Together, the results indicate that T-cells were substantially and specifically depleted in blood and in secondary lymphoid organs of TCS1P1KO mice. Mature T-cells Accumulate in the TCS1P1KO Thymus—To determine whether the absence of the S1P1 receptor was affecting thymocyte differentiation, we analyzed T-cell subpopulations in the thymus. The T-cell-specific deletion of the S1P1 receptor resulted in an overall increase in the proportion of mature thymocytes. Thymi from TCS1P1KO mice contained a higher proportion of mature single positive CD4+CD8- and CD4-CD8+ cells and a decreased proportion of the less mature CD4+CD8+ double positive cells compared with controls. There was not a significant change in the level of immature double negative CD4-CD8- thymocytes (Fig. 4, A and B). The percentages of the relatively mature CD3high (Fig. 4, C and D) and CD62Lhigh (Fig. 4, E and F) thymocytes were also increased in TCS1P1KO mice relative to controls. High expression of these markers is characteristic of fully mature thymocytes with potential for thymic emigration (30Gabor M.J. Godfrey D.I. Scollay R. Eur. J. Immunol. 1997; 27: 2010-2015Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 31Lee C.K. Kim K. Welniak L.A. Murphy W.J. Muegge K. Durum S.K. Blood. 2001; 97: 1360-1369Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). In particular, single positive CD4+CD8- and CD4-CD8+ cells from TCS1P1KO mice expressed higher levels of CD62L than controls (Fig. 4, E and F). In contrast, no differences were observed in CD62L expression on the less mature double positive CD4+CD8+ cells from TCS1P1KO mice compared with controls (Fig. 4, E and F). The results indicate that TCS1P1KO thymocytes have the ability to mature but that these mature T-cells accumulate in the thymus. Histological analysis of thymi from TCS1P1KO mice indicated that the overall architecture of the organ was intact (Fig. 5, A and B). The TCS1P1KO thymi showed enlarged medullary areas with increased CD3 expression compared with control sections (Fig. 5, C and D) consistent with an accumulation of mature T-cells. Impaired Thymic Emigration in TCS1P1KO Mice—To determine whether the reduction of T-cells in the periphery was the result of impaired emigration from the thymus, we injected FITC into the thymus to trace recent thymic emigrants. FITC binds to proteins on the cell surface of thymocytes, which retain the modification after thymocytes exit the thymus and migrate to the periphery (30Gabor M.J. Godfrey D.I. Scollay R. Eur. J. Immunol. 1997; 27: 2010-2015Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar). Twenty h following the intrathymic FITC injection, the number of recent thymic emigrants in the spleen of TCS1P1KO mice (identified as PE-CD3+FITC+ cells) was found to be significantly reduced by about 60% compared with controls (Fig. 6B). The reduced number of recent thymic emigrants substantiates a defect in emigration of mature T-cells from thymus to the periphery in the TCS1P1KO mice. Up-regulation of the S1P1 Receptor on Mature Thymocytes—We analyzed the expression level of the S1P1 receptor in normal thymocytes by flow cytometry using a polyclonal antibody against S1P1. The results revealed that mature, single positive CD4+CD8- and CD4-CD8+ thymocytes expressed substantially higher levels of S1P1 receptor protein compared with less mature double positive CD4+CD8+ thymocytes (Fig. 6A). Next we determined the relative responses of single positive CD4+CD8- and CD4-CD8+ and double positive CD4+CD8+ thymocytes to sphingosine 1-phosphate in a chemotaxis assay. A significantly higher ratio of mature single positive to less mature double positive cells was found in the lower chamber of the chemotaxis apparatus when it contained sphingosine 1-phosphate compared with medium alone. This response to sphingosine 1-phosphate was lost in TCS1P1KO thymocytes (Fig. 6C). The S1P1 receptor is expressed on diverse cell and tissue types suggesting that the signaling pathway mediated by this receptor may be involved in multiple physiological processes. Earlier results from gene-targeted mice had revealed an essential role for the S1P1 receptor in endothelial cells in regulating the formation of stable blood vessels (11Liu Y. Wada R. Yamashita T. Mi Y. Deng C.X. Hobson J.P. Rosenfeldt H.M. Nava V.E. Chae S.S. Lee M.J. Liu C.H. Hla T. Spiegel S. Proia R.L. J. Clin. Investig. 2000; 106: 951-961Crossref PubMed Scopus (993) Google Scholar, 12Allende M.L. Yamashita T. Proia R.L. Blood. 2003; 102: 3665-3667Crossref PubMed Scopus (316) Google Scholar). The results presented here demonstrate that the S1P1 receptor on T-cells has a crucial function in the process by which T-cells exit from the thymus and enter the blood. With the T-cell-specific deletion of the S1P1 receptor, mature T-cells accumulated in the thymus. Intrathymic labeling of thymocytes provided direct evidence that emigration of mature thymocytes was impaired in TCS1P1KO mice. As a result of the defect in thymic exit, much lower numbers of T-cells were found in the secondary lymphoid organs compared with controls. Thymocyte egress is known to require a Gαi signaling pathway. Mice expressing the catalytic subunit of pertussis toxin in thymocytes (an inhibitor of the Gαi pathway) accumulate mature T-cells in the thymus (32Chaffin K.E. Perlmutter R.M. Eur. J. Immunol. 1991; 21: 2565-2573Crossref PubMed Scopus (135) Google Scholar), thus resembling the phenotype of the TCS1P1KO mice. Because the S1P1 receptor signals exclusively through Gαi, the pertussis toxin inhibition of thymocyte egress is likely to be at least partially caused by a block in the S1P1 receptor signaling pathway. We have shown that the S1P1 receptor level is up-regulated in mature single positive thymocytes relative to less mature double positive thymocytes. Also, we determined that sphingosine 1-phosphate increased the ratio of mature single positive thymocytes to less mature double positive thymocytes in a chemotaxis assay and that this response is mediated by the S1P1 receptor. Together, these results are consistent with a role for receptor expression in regulating the thymic exit process. S1P1 receptor signaling may control the emigration of T-cells from the thymus either directly or indirectly. Sphingosine 1-phosphate levels are known to be very high (0.1-1 μm) in the blood relative to various tissues (33Yatomi Y. Ozaki Y. Ohmori T. Igarashi Y. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001; 64: 107-122Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar) and may directly stimulate the migration of mature thymocytes out of the thymus via a sphingosine 1-phosphate-directed chemotactic response. Indeed, sphingosine 1-phosphate, via signaling through the S1P1 receptor, previously has been shown to be a chemotactic factor for a variety of cell types including T-lymphocytes (8Spiegel S. Milstien S. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 397-407Crossref PubMed Scopus (1758) Google Scholar, 17Graeler M. Shankar G. Goetzl E.J. J. Immunol. 2002; 169: 4084-4087Crossref PubMed Scopus (110) Google Scholar, 34Graler M.H. Goetzl E.J. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1582: 168-174Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar). Alternatively, sphingosine 1-phosphate may regulate the responses of thymocytes to thymic chemokines important for retention or emigration. Sphingosine 1-phosphate has been demonstrated to regulate the chemotactic responses of T-cells to chemokines in a concentration-dependent manner (17Graeler M. Shankar G. Goetzl E.J. J. Immunol. 2002; 169: 4084-4087Crossref PubMed Scopus (110) Google Scholar, 35Honig S.M. Fu S. Mao X. Yopp A. Gunn M.D. Randolph G.J. Bromberg J.S. J. Clin. Investig. 2003; 111: 627-637Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar). The S1P receptor agonist FTY720, after phosphorylation by a sphingosine kinase, binds to 4 of the 5 S1P receptors, including S1P1, and causes the redistribution of lymphocytes from the circulation to secondary lymphoid tissues (19Brinkmann V. Davis M.D. Heise C.E. Albert R. Cottens S. Hof R. Bruns C. Prieschl E. Baumruker T. Hiestand P. Foster C.A. Zollinger M. Lynch K.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 21453-21457Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1314) Google Scholar, 22Mandala S. Hajdu R. Bergstrom J. Quackenbush E. Xie J. Milligan J. Thornton R. Shei G.J. Card D. Keohane C. Rosenbach M. Hale J. Lynch C.L. Rupprecht K. Parsons W. Rosen H. Science. 2002; 296: 346-349Crossref PubMed Scopus (1435) Google Scholar). In the thymus, FTY720 at low doses and within a short period of time triggers a maturation of single positive cells to a late medullary phenotype and, ultimately, causes an inhibition of T-cell emigration without changes in the total single positive cell numbers (26Rosen H. Alfonso C. Surh C.D. McHeyzer-Williams M.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 10907-10912Crossref PubMed Scopus (112) Google Scholar). With prolonged FTY720 treatment, mice show an increase in mature single positive cells in the thymus and a block in emigration of T-cells to the periphery (25Yagi H. Kamba R. Chiba K. Soga H. Yaguchi K. Nakamura M. Itoh T. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 1435-1444Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar). These results with FTY720 point to an important role of S1P receptors in regulating T-cell trafficking in the thymus and in the periphery. However, it has not been clear which S1P receptors mediate these effects; S1P1, S1P3, S1P4, and S1P5 receptors all respond to phosphorylated FTY720. Also unknown are which cells might be targeted. S1P receptor signaling might regulate trafficking directly within lymphocytes or via alterations in the endothelium. The similarity of the thymic phenotype of TCS1P1KO mice with mice after prolonged treatment with FTY720 would be consistent with a model where phosphorylated FTY720 exerts an effect via an interaction with the S1P1 receptor on T-cells. However, our data with the T-cell specific knock-out of S1P1 raises the possibility that FTY720 actions may actually be the result of an inhibition of the S1P1 receptor-signaling pathway, possibly by desensitization caused by constant stimulation with the agonist. In general, early desensitization of G protein-coupled receptors occurs rapidly after agonist exposure and involves phosphorylation and sequestration of the receptor (36Pierce K.L. Premont R.T. Lefkowitz R.J. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002; 3: 639-650Crossref PubMed Scopus (2105) Google Scholar). In fact, sphingosine 1-phosphate induces S1P1 receptor internalization into a perinuclear endosomal compartment (37Liu C.H. Thangada S. Lee M.J. Van Brocklyn J.R. Spiegel S. Hla T. Mol. Biol. Cell. 1999; 10: 1179-1190Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar). A more acute inhibition process, which involves a decrease in receptor presence on the cell surface because of down-regulation or internalization and lysosomal degradation, may be observed after a prolonged agonist exposure (36Pierce K.L. Premont R.T. Lefkowitz R.J. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002; 3: 639-650Crossref PubMed Scopus (2105) Google Scholar). In summary, our data are consistent with a model where the S1P1 receptor in maturing thymocytes is a key regulator of T-cell egress from the thymus (Fig. 6D). The regulated expression of S1P1 receptor levels may control responsiveness to the high levels of sphingosine 1-phosphate in blood, which selectively induces mature T-cell migration to the periphery. Similarities between the process of lymphocyte egress from the thymus and lymph nodes suggest that the latter process might also be dependent on the S1P1 receptor on lymphocytes.