Abstract Molecular profiling of the tumour immune microenvironment (TIME) has enabled the rational choice of immunotherapies in some adult cancers. In contrast, the TIME of paediatric cancers is relatively unexplored. We speculated that a more refined appreciation of the TIME in childhood cancers, rather than a reliance on commonly used biomarkers such as tumour mutation burden (TMB), neoantigen load and PD-L1 expression, is an essential prerequisite for improved immunotherapies in childhood solid cancers. We combined immunohistochemistry (IHC) and molecular profiling to develop an alternative, expression-based signature associated with CD8 + T-cell infiltration of the TIME in high-risk paediatric tumours. Using this novel 15-gene immune signature, Immune Paediatric Signature Score (IPASS), we estimate up to 31% of high-risk cancers harbour infiltrating T-cells. Our data provides new insights into the variable immune-suppressive mechanisms dampening responses in paediatric solid cancers. Effective immune-based interventions in high-risk paediatric cancer will require individualised analysis of the TIME.

Abstract BACKGROUND “Head Start-4” (HS-4) is a prospective, randomized clinic trial that tailors treatment based on medulloblastoma molecular subgroups (WNT, SHH, Group 3, and Group 4) and response to induction chemotherapy, and compares the efficacy of one versus three (tandem) cycles of myeloablative therapy. Here we compare different methodologies used to distinguish between WNT/SHH medulloblastoma (low-risk arm) and non-SHH/non-WNT medulloblastoma (high-risk arm) during the course of the trial. METHODS When HS-4 trial began enrolling patients in 2015, in the absence of a CAP-CLIA certified test for methylation and gene expression profile, we utilized histopathology/immunochemistry (HP/IHC) and chromosomal microarray (CMA) via OncoScanTM (Thermo Fisher) to classify medulloblastoma samples into either WNT, SHH, or non-WNT/non-SHH (Subgroups 3 and 4) at the time of diagnosis. Retrospectively, we performed both NanoString based 22-gene assay and DNA methylation profiling on all patient samples. RESULTS We have HP/IHC, CMA, NanoString and methylation profiling for 54 infants and young children with medulloblastoma enrolled on HS-4. While indeterminate result occurred with CMA in three cases and NanoString in two cases, HP/IHC successfully assigned samples to SHH/WNT and non-SHH/non-WNT arms of the study in all 54 cases. We have HP/IHC, CMA and DNA methylation profiling for additional 33 patients. While pathology/IHC was indeterminate in two cases (one WNT and one group 3 MB), remaining cases accurately categorized medulloblastoma methylation subtype as WNT/SHH and non-WNT/non-SHH. CONCLUSION Due to the long turnaround time, waiting for medulloblastoma molecular subtype confirmation by DNA methylation array may delay treatment initiation. HS-4 data displays robust prediction of WNT/SHH versus non-WNT/non-SHH molecular subtypes by HP/IHC in comparison to DNA methylation profiling and provides a platform to initiate treatment based on HP/IHC while awaiting molecular information. In addition, these data support relying on histopathology for medulloblastoma subtypes in resource poor countries where methylation profiling is not readily available.

ABSTRACT Mutations in hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) can remain dormant within the bone marrow (BM) for decades before leukemia onset. Understanding the mechanisms by which these mutant clones eventually slead to full blown leukemia is of critical importance to develop strategies to eliminate these clones before they achieve their full leukemogenic potential. Recent data suggest that leukemic stem cells (LSCs) induce alterations within BM microenvironment (BMM) favoring LSC growth over normal HSCs. However, the cross talk between preleukemic stem cells (pLSC) and BMM is not completely understood. We hypothesize that pLSC induces critical changes within the BMM that are critical for leukemogenesis. To address this question, we are using our previously developed murine model of AML that highly recapitulates the human disease, develops AML sporadically with a preleukemic phase in which mice display normal white blood counts (WBCs) and absence of blasts in the BM. Thus, this is an excellent model to evaluate changes in the BMM that occurs during progression into AML. Using this model we performed single cell RNA-sequencing on cells from the BMM compared to wild-type (WT) controls. Overall, we defined the transcriptional profiles of pre-leukemic BMM cells and observed decreased percentages of normal BMM cells such as LepR+ mesenchymal stem cells (MSCs) and endothelial cells (ECs), known to regulate normal HSC function. Concomitantly, we found increases in CD55+ fibroblasts and NG2+ pericytes, that might play a more important role in regulation of pre-LSCs. Preleukemic CD55+ fibroblasts had a higher proliferation rate and showed significant down-regulation of several collagen genes known for regulating extra cellular matrix (ECM) including: Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col4a1 , and Col6a1, suggesting that ECM remodeling occurs in the early stages of leukemogenesis. Importantly, co-culture assays found that pre-leukemic CD55+ BM fibroblasts expanded pre-LSCs significantly over normal HSCs. In conclusion, we have identified distinct changes in the preleukemic BMM and identified a novel CD55+ fibroblast population that is expanded in preleukemic BMM that promote the fitness of pre-LSCs over normal HSCs. STATEMENT OF SIGNIFICANCE We have identified changes in the BMM landscape that define a preleukemic BM niche which includes the expansion of a novel CD55+ fibroblast population. These data suggest that a distinct preleukemic BM niche exists and preferentially supports LSC survival and expansion over normal HSCs to promote leukemogenesis.

ABSTRACT Low grade gliomas (LGG) account for about two-thirds of all glioma diagnoses in adolescents and young adults (AYA) and malignant progression of these patients leads to dismal outcomes. Recent studies have shown the importance of the dynamic tumor microenvironment in high-grade gliomas (HGG ), yet its role is still poorly understood in low-grade glioma malignant progression. Here, we investigated the heterogeneity of the immune microenvironment using a platelet-derived growth factor ( PDGF )-driven RCAS (replication-competent ASLV long terminal repeat with a splice acceptor) glioma model that recapitulates the malignant progression of low to high-grade glioma in humans and also provides a model system to characterize immune cell trafficking and evolution. To illuminate changes in the immune cell landscape during tumor progression, we performed single-cell RNA sequencing on immune cells isolated from animals bearing no tumor (NT) , LGG and HGG, with a particular focus on the myeloid cell compartment, which is known to mediate glioma immunosuppression. LGGs demonstrated significantly increased infiltrating T cells, CD4 T cells, CD8 T cells, B cells, and natural killer cells in the tumor microenvironment, whereas HGGs significantly abrogated this infiltration. Our study identified two distinct macrophage clusters in the tumor microenvironment; one cluster appeared to be bone marrow-derived while another was defined by overexpression of Trem2, a marker of tumor associated macrophages. Our data demonstrates that these two distinct macrophage clusters show an immune-activated phenotype ( Stat1, Tnf, Cxcl9 and Cxcl10 ) in LGG which evolves to an immunosuppressive state ( Lgals3, Apoc1 and Id2 ) in HGG that restricts T cell recruitment and activation. We identified CD74 and macrophage migration inhibition factor ( MIF ) as potential targets for these distinct macrophage populations. Interestingly, these results were mirrored by our analysis of the TCGA dataset, which demonstrated a statistically significant association between CD74 overexpression and decreased overall survival in AYA patients with grade II gliomas. Targeting immunosuppressive myeloid cells and intra-tumoral macrophages within this therapeutic window may ameliorate mechanisms associated with immunosuppression before and during malignant progression.

ABSTRACT Here we describe a neonate exhibiting hypotonia, macrocephaly, renal cysts, and respiratory failure requiring tracheostomy and ventilator support. Genetic analysis via rapid genome sequencing (rGS) identified a loss on chromosome 4 encompassing polycystin‐2 ( PKD2 ) and a loss on chromosome 22 encompassing SH3 and Multiple Ankyrin Repeat Domains 3 ( SHANK3 ), indicative of Phelan‐McDermid syndrome. Further analysis via traditional karyotyping, Optical Genome Mapping (OGM), and PacBio long‐read sequencing revealed a more complex landscape of chromosomal rearrangements in this individual, including a balanced 3;12 translocation, and an unbalanced 17;22 translocation. The proband's phenotypic presentation is thought to be the result of Phelan‐McDermid syndrome and represents an expansion of the described phenotypes to include significant respiratory failure. This study underscores the challenges and importance of comprehensive genetic testing in elucidating complex presentations and highlights the need for complementary testing methods to overcome limitations in resolution.

A bstract Background Pediatric cancers typically have a distinct genomic landscape when compared to adult cancers and frequently carry somatic gene fusion events that alter gene expression and drive tumorigenesis. Sensitive and specific detection of gene fusions through the analysis of next-generation-based RNA sequencing (RNA-Seq) data is computationally challenging and may be confounded by low tumor cellularity or underlying genomic complexity. Furthermore, numerous computational tools are available to identify fusions from supporting RNA-Seq reads, yet each algorithm demonstrates unique variability in sensitivity and precision, and no clearly superior approach currently exists. To overcome these challenges, we have developed an ensemble fusion calling approach to increase the accuracy of identifying fusions. Results Our ensemble fusion detection approach utilizes seven fusion calling algorithms: Arriba, CICERO, FusionMap, FusionCatcher, JAFFA, MapSplice, and STAR-Fusion, which are packaged as a fully automated pipeline using Docker and AWS serverless technology. This method uses paired end RNA-Seq sequence reads as input, and the output from each algorithm is examined to identify fusions detected by a consensus of at least three algorithms. These consensus fusion results are filtered by comparison to an internal database to remove likely artifactual fusions occurring at high frequencies in our internal cohort, while a “known fusion list” prevents failure to report known pathogenic events. We have employed the ensemble fusion-calling pipeline on RNA-Seq data from 229 patients with pediatric cancer or blood disorders studied under an IRB-approved protocol. The samples consist of 138 central nervous system tumors, 73 solid tumors, and 18 hematologic malignancies or disorders. The combination of an ensemble fusion-calling pipeline and a knowledge-based filtering strategy identified 67 clinically relevant fusions among our cohort (diagnostic yield of 29.3%), including RBPMS-MET, BCAN-NTRK1 , and TRIM22-BRAF fusions. Following clinical confirmation and reporting in the patient’s medical record, both known and novel fusions provided medically meaningful information. Conclusions Our ensemble fusion detection pipeline offers a streamlined approach to discover fusions in cancer, at higher levels of sensitivity and accuracy than single algorithm methods. Furthermore, this method accurately identifies driver fusions in pediatric cancer, providing clinical impact by contributing evidence to diagnosis and, when appropriate, indicating targeted therapies.