Retinitis pigmentosa is an untreatable, inherited retinal disease that leads to blindness. The disease initiates with the loss of night vision due to rod photoreceptor degeneration, followed by irreversible, progressive loss of cone photoreceptor1,2,3. Cone loss is responsible for the main visual handicap, as cones are essential for day and high-acuity vision4. Their loss is indirect, as most genes associated with retinitis pigmentosa are not expressed by these cells. We previously showed that factors secreted from rods are essential for cone viability5,6,7,8. Here we identified one such trophic factor by expression cloning and named it rod-derived cone viability factor (RdCVF). RdCVF is a truncated thioredoxin-like protein specifically expressed by photoreceptors. The identification of this protein offers new treatment possibilities for retinitis pigmentosa.

Mutations in the gene ABCA4 coding for photoreceptor-specific ATP-binding cassette subfamily A member 4, are responsible for the most common form of inherited macular degeneration known as Stargardt Disease type 1 (STGD1). STGD1 typically declares early in life and leads to severe visual handicap. Abca4 gene deletion mouse models of STGD1 show increased accumulation of lipofuscin, a hallmark of the disease, but unlike the human disease show mostly no photoreceptor degeneration or functional decline (an albino Abca4-/- mouse exhibits photoreceptor degeneration although functional parameters were not studied). Reasoning that the small cone population of mice (<3%) might compromise more faithful modelling of human maculopathies, we performed subretinal injections of CRISPR/Cas9-Abca4 recombinant Adeno-Associated Virus constructs into young Fat Sand Rats (Psammomys obesus), a diurnal rodent containing >30% cones. Sanger sequencing of the CRISPR-targeted sequence showed clear edition of the Abca4 gene. At 2 months post-injection, non-invasive fundus imaging showed widespread photoreceptor loss, confirmed by optical coherence tomography. Functional recording by scotopic and photopic single flash, and photopic flicker electroretinography, showed significant decline in photopic (cone) but not scotopic (rod) light responses. Post-mortem real-time PCR, immunohistochemistry and western blotting showed significant decrease of cone-specific (MW cone opsin) but not rod-specific (rhodopsin) markers. Transmission electron microscopy showed large numbers of lipid inclusions in treated but not control retinal pigmented epithelium. Finally, ultrahigh performance liquid chromatographic analysis of whole P. obesus eyes showed the presence of all-trans retinal-dimer, also seen in Abca4-/- mice but not normal rod-rich mouse or rat eyes. In conclusion, this animal model of STGD1 more accurately reflects human STGD1 and should be valuable for characterizing pathogenic pathways and exploring treatment options.

Abstract Retinal photoreceptors undergo daily renewal of their distal outer segments, a process indispensable for maintaining retinal health. Photoreceptor Outer Segment (POS) phagocytosis occurs as a daily peak, roughly about one hour after light onset. However, the underlying cellular and molecular mechanisms which initiate this process are still unknown. Here we show that, under constant darkness, mice deficient for core circadian clock genes ( Per1 and Per2 ), lack a daily peak in POS phagocytosis. By qPCR analysis we found that core clock genes were rhythmic over 24h in both WT and Per1, Per2 double mutant whole retinas. More precise transcriptomics analysis of laser capture microdissected WT photoreceptors revealed no differentially, expressed genes between time-points preceding and during the peak of POS phagocytosis. By contrast, we found that microdissected WT retinal pigment epithelium (RPE) had a number of genes that were differentially expressed at the peak phagocytic time-point compared to adjacent ones. We also found a number of differentially expressed genes in Per1, Per2 double mutant RPE compared to WT ones at the peak phagocytic time-point. Finally, based on STRING analysis we found a group of interacting genes which potentially drive POS phagocytosis in the RPE. This potential pathway consists of genes such as: Pacsin1 , Syp , Camk2b and Camk2d among others. Our findings indicate that Per1 and Per2 are necessary clock components for driving POS phagocytosis and suggest that this process is transcriptionally driven by the RPE. Declarations Funding This project has been funded with support from the NeuroTime Erasmus+ grant (European Union), Rotterdamse Stichting Blindenbelangen (Netherlands), Nelly Reef fund (Netherlands), Stichting voor Ooglijders (Netherlands), Stichting tot Verbetering van het Lot der Blinden (Netherlands) and Retina France (France). Conflicts of interest/Competing interests The authors declare no competing interests. Availability of data and material Data supporting the conclusions of this article are included within the article and are available from the corresponding authors on reasonable request. Code availability The R code for analysis is available from the corresponding authors on reasonable request. Ethics approval All experimental procedures were performed in accordance with the Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement on Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research, as well as with the European Union Directive (2010/63/EU). Consent to participate Not applicable Consent for publication All authors read and approve of the contents of this manuscript. Author contributions N.M. performed experiments, analysis, prepared figures, wrote the manuscript and obtained funding. O.A.-H.H. performed experiments, data analysis, prepared figures and obtained funding. P.D.M. and A.J. performed bioinformatics analysis and edited the manuscript. U.B., J.B.t.B. and C.S. provided technical assistance, performed experiments, prepared figures and edited the manuscript. D.H., A.A.B. and M.-P.F.-S. conceptualized and directed the project, obtained funding, provided resources, performed analysis and edited the manuscript.

Abstract Purpose A burst in phagocytosis of spent photoreceptor outer fragments by retinal pigment epithelium (RPE) is a rhythmic process occurring 1-2 hours after the onset of light. This phenomenon is considered crucial for the health of the photoreceptors and RPE. We have recently reported that dopamine, via dopamine 2 receptor (D 2 R), shifts the circadian rhythm in the RPE. Methods Here, we first investigated the impact of the removal of D 2 R on the daily peak of phagocytosis by RPE and then we analyzed the function and morphology of retina and RPE in the absence of D 2 R. Results D 2 R KO mice do not show a daily burst of phagocytic activity after the onset of light. Also, in contrast to control, phosphorylation of FAK did not increase significantly in KO mice at ZT1. RNA sequencing revealed a total of 394 differentially expressed genes (DEGs) between ZT23 and ZT1 in the control mice, whereas in D 2 R KO mice, we detected 1054 DEGs. Pathway analysis of the gene expression data implicated integrin signaling to be one of the upregulated pathways in control but not in D 2 R KO mice. No difference in retinal thickness, visual function, or morphology of RPE cells was observed between WT and D 2 R KO mice at the age of 3 and 12 months. Conclusions Our data suggest that removal of D 2 R prevents the burst in phagocytosis and a related increase in the phosphorylation of FAK after light onset. The pathway analysis points towards a putative role of D 2 R in controlling integrin signaling, which is known to play an important role in the control of the daily burst of phagocytosis by the RPE. Our data also indicate that the absence in the burst of phagocytic activity in the early morning does not produce any apparent deleterious effect on the retina or RPE up to one year of age.

Abstract The circadian system is a hierarchical network of cell and tissue-specific oscillators synchronized to the environmental light/dark cycle. Entrainment is mediated by the retina through diverse photosensitive cells and pigments. The retina is itself a complex circadian system whose cellular constitutive elements have not been fully characterized. By using the Nrl -/- cone gain-of-function mouse model we here show that the retinal network comprises an autonomous oscillator harbored in cones. We further provide novel evidence for an input from cones to the master clock, as revealed under constant light condition.