ABSTRACT Understanding carbon flux-controlling mechanisms in a tangled metabolic network is an essential question of cell metabolism. Secondary metabolism, such as terpene biosynthesis, has evolved with low carbon flux due to inherent pathway constraints. Thraustochytrids are a group of heterotrophic marine unicellular protists, and can accumulate terpenoids under the high salt condition in their natural environment. However, the mechanism behind the terpene accumulation is not well understood. Here we show that terpene biosynthesis in Thraustochytrium sp. ATCC 26185 is constrained by local thermodynamics in the mevalonate pathway. Thermodynamic analysis reveals the metabolite limitation in the nondecarboxylative Claisen condensation of acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA step catalyzed by the acetyl-CoA acetyltransferase (ACAT). Through a sodium elicited mechanism, higher respiration leads to increased ATP investment into the mevalonate pathway, providing a strong thermodynamic driving force for enhanced terpene biosynthesis. The proteomic analysis further indicates that the increased ATP demands are fulfilled by shifting energy generation from carbohydrate to lipid metabolism. This study demonstrates a unique strategy in nature using ATP to drive a low-flux metabolic pathway, providing an alternative solution for efficient terpene metabolic engineering. IMPORTANCE Terpenoids are a large class of lipid molecules with important biological functions, and diverse industrial and medicinal applications. Metabolic engineering for terpene production has been hindered by the low flux distribution to its biosynthesis pathway. In practice, a high substrate load is generally required to reach high product titers. Here we show that the mevalonate-derived terpene biosynthesis is constrained by local pathway thermodynamics, which can only be partially relieved by increasing substrate levels. Through comparative proteomic and biochemical analyses, we discovered a unique mechanism for high terpene accumulation in marine protists thraustochytrids. Through a sodium induced mechanism, thraustochytrids shift their energy metabolism from carbohydrate to lipid metabolism for enhanced ATP production, providing a strong thermodynamic driving force for efficient terpene biosynthesis. This study reveals an important mechanism in eukaryotes to overcome the thermodynamic constraint in low-flux pathways by increased ATP consumption. Engineering energy metabolism thus provides an important alternative to relieve flux constraints in low-flux and energy-consuming pathways.

Abstract Myristoylation is a post-translational modification that plays diverse functional roles in many protein species. The myristate moiety is considered insufficient for protein-membrane associations unless additional membrane-affinity motifs, such as a stretch of positively charged residues, are present. Here, we report that the electrically neutral N-terminal fragment of the protein kinase A catalytic subunit (PKA-C), in which myristoylation is the only functional motif, is sufficient for membrane association. This myristoylation can associate a fraction of PKA-C molecules or fluorescent proteins (FPs) to the plasma membrane in neuronal dendrites. The net neutral charge of PKA-C is evolutionally conserved, even though its membrane affinity can be readily tuned by changing charges near the myristoylation site. The observed membrane association, while moderate, is sufficient to concentrate PKA activity at the membrane by nearly 20-fold, and is required for PKA regulation of AMPA receptors at neuronal synapses. Our results indicate that myristoylation alone may be sufficient to drive functionally significant membrane association in the absence of assisting motifs. This provides a revised foundation for the understanding of how myristoylation regulates protein functions.

Protein kinase A (PKA) plays essential roles in diverse cellular functions. However, the spatiotemporal dynamics of endogenous PKA upon activation remain debated. The classical model predicts that PKA catalytic subunits dissociate from regulatory subunits in the presence of cAMP, whereas a second model proposes that catalytic subunits remain associated with regulatory subunits following physiological activation. Here we report that different PKA subtypes, as defined by the regulatory subunit, exhibit distinct subcellular localization at rest in CA1 neurons of cultured hippocampal slices. Nevertheless, when all tested PKA subtypes are activated via the β-adrenergic receptor by norepinephrine, catalytic subunits translocate to dendritic spines but regulatory subunits remain unmoved. These differential spatial dynamics between the subunits indicate that at least a significant fraction of PKA dissociates. Furthermore, PKA-dependent regulation of synaptic plasticity and transmission can be supported only by wildtype, dissociable PKA, but not by non-dissociable PKA. These results argue for the classical model in which endogenous PKA regulatory and catalytic subunits dissociate to achieve PKA function.