Abstract Protein-protein interactions govern almost all cellular functions. These complex networks of stable and transient associations can be mapped by affinity purification mass spectrometry (AP-MS) and complementary proximity-based labeling methods such as BioID. To exploit the advantages of both strategies, we here design and optimize an integrated approach combining AP-MS and BioID in a single construct, which we term MAC-tag. We systematically apply the MAC-tag approach to 18 subcellular and 3 sub-organelle localization markers, generating a molecular context database, which can be used to define a protein’s molecular location. In addition, we show that combining the AP-MS and BioID results makes it possible to obtain interaction distances within a protein complex. Taken together, our integrated strategy enables the comprehensive mapping of the physical and functional interactions of proteins, defining their molecular context and improving our understanding of the cellular interactome.

Summary Much cell-to-cell communication is facilitated by cell surface receptor tyrosine kinases (RTKs). These proteins phosphorylate their downstream cytoplasmic substrates in response to stimuli such as growth factors. Despite their central roles, the functions of many RTKs are still poorly understood. To resolve the lack of systematic knowledge, we used three complementary methods to map the molecular context and substrate profiles of RTKs. We used affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) to characterize stable binding partners and RTK-protein complexes, proximity-dependent biotin identification (BioID) to identify transient and proximal interactions, and an in vitro kinase assay to identify RTK substrates. To identify how kinase interactions depend on kinase activity, we also used kinase-deficient mutants. Our data represent a comprehensive, systemic mapping of RTK interactions and substrates. This resource adds information regarding well-studied RTKs, offers insights into the functions of less well-studied RTKs, and highlights RTK-RTK interactions and shared signaling pathways.

The Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1) - Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) pathway is the major transcriptional stress response system in cells against oxidative and electrophilic stress. NRF2 is frequently constitutively active in many cancers, rendering the cells resistant to chemo- and radiotherapy. Loss-of-function (LOF) mutations in the repressor protein KEAP1 are common in non-small cell lung cancer, particularly adenocarcinoma. While the mutations can occur throughout the gene, they are enriched in certain areas, indicating that these may have unique functional importance. In this study, we show that in the GSEA analysis of TCGA lung adenocarcinoma RNA-seq data, the KEAP1 mutations in R320 and R470 were associated with enhanced Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) - Nuclear Factor kappa subunit B (NFκB) signaling as well as MYC and MTORC1 pathways. To address the functional role of these hotspot mutations, affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) analysis of wild type (wt) KEAP1 and the mutants was employed to interrogate differences in the protein interactome. We identified TNF receptor associated factor 2 (TRAF2) as a putative protein interaction partner. Both mutant KEAP1 forms showed increased interaction with TRAF2 and other anti-apoptotic proteins, suggesting that apoptosis signalling could be affected by the protein interactions. A549 lung adenocarcinoma cells overexpressing mutant KEAP1 showed high TRAF2-mediated NFκB activity and increased protection against apoptosis, XIAP being one of the key proteins involved in anti-apoptotic signalling. To conclude, KEAP1 R320Q and R470C and its interaction with TRAF2 leads to activation of NFκB pathway, thereby protecting against apoptosis.

Abstract Mitochondria contain a multi-copy genome and a distinct set of ribosomes devoted to the exclusive synthesis of proteins that are essential for oxidative phosphorylation. The assembly of mitoribosomes for mitochondrial translation is a poorly understood process. In this study, we identify the uncharacterized GTP-binding protein 8 (GTPBP8) as a mitoribosomal assembly factor that specifically associates with the mitoribosomal large subunit. Genetic depletion of GTPBP8 causes an aberrant accumulation of the large mitoribosomal subunit at a late assembly stage and reduces the level of fully assembled 55S mitoribosomes, resulting in impaired mitochondrial translation and function. Together, our findings uncover an important role for human GTPBP8 in the processes of mitoribosomal assembly and mitochondrial translation. Key points GTPBP8 is a novel GTPase residing in the matrix peripherally bound to the inner mitochondrial membrane GTPBP8 specifically associates with the large mitoribosome subunit through interactions with large mitoribosomal proteins assembled at late stages. GTPBP is essential for maturation of the mitoribosomal large subunit and monosome formation

ABSTRACT Cardiolipin (CL) is an essential phospholipid for mitochondrial structure and function. Here we present a small mitochondrial protein, NERCLIN, as a negative regulator of CL homeostasis and mitochondrial ultrastructure. Primate-specific NERCLIN is expressed ubiquitously from GRPEL2 locus on a tightly regulated low level, but induced by heat stress. NERCLIN overexpression severely disrupts mitochondrial cristae structure and induces mitochondrial fragmentation. Proximity labeling suggested interactions of NERCLIN with CL synthesis and prohibitin complexes on the matrix side of the inner mitochondrial membrane. Lipid analysis indicated that NERCLIN regulates mitochondrial CL content. The regulation may occur directly through interaction with PTPMT1, a proximal partner on the CL synthesis pathway, as its product phosphatidylglycerol was also reduced by NERCLIN. We propose that NERCLIN contributes to stress-induced adaptation of mitochondrial dynamics and turnover by regulating the mitochondrial CL content. Our findings add NERCLIN to the group of recently identified small mitochondrial proteins with important regulatory functions.

Contractile actomyosin bundles play crucial roles in various physiological processes, including cell migration, morphogenesis, and muscle contraction. The intricate assembly of actomyosin bundles involves the precise alignment and fusion of myosin II filaments, yet the underlying mechanisms and factors involved in these processes remain elusive. Our study reveals that LUZP1 plays a central role in orchestrating the maturation of thick actomyosin bundles. Loss of LUZP1 caused abnormal cell morphogenesis, migration, and the ability to exert forces on the environment. Importantly, knockout of LUZP1 results in significant defects in the concatenation and persistent association of myosin II filaments, severely impairing the assembly of myosin II stacks. The disruption of these processes in LUZP1 knockout cells provides mechanistic insights into the defective assembly of thick ventral stress fibers and the associated cellular contractility abnormalities. Overall, these results significantly contribute to our understanding of the molecular mechanism involved in actomyosin bundle formation and highlight the essential role of LUZP1 in this process.

Protein-protein interactions underlie almost all cellular functions. The comprehensive mapping of these complex cellular networks of stable and transient associations has been made available by affinity purification mass spectrometry (AP-MS) and more recently by proximity based labelling methods such as BioID. Due the advancements in both methods and MS instrumentation, an in-depth analysis of the whole human proteome is at grasps. In order to facilitate this, we designed and optimized an integrated approach utilizing MAC-tag combining both AP-MS and BioID in a single construct. We systematically applied this approach to 18 subcellular localization markers and generated a molecular context database, which can be used to define molecular locations for any protein of interest. In addition, we show that by combining the AP-MS and BioID results we can also obtain interaction distances within a complex. Taken together, our combined strategy offers comprehensive approach for mapping physical and functional protein interactions.

Abstract Contractile actomyosin bundles play crucial roles in various physiological processes, including cell migration, morphogenesis, and muscle contraction. The intricate assembly of actomyosin bundles involves the precise alignment and fusion of myosin II filaments, yet the underlying mechanisms and factors involved in these processes remain elusive. Our study reveals that LUZP1, a leucine zipper protein, plays a central role in orchestrating the formation of thick actomyosin bundles. Loss of LUZP1 caused abnormal cell morphogenesis, migration, and the ability to exert forces on the environment. Importantly, knockout of LUZP1 results in significant defects in the concatenation and persistent association of myosin II filaments, severely impairing the assembly of myosin II stacks. The disruption of these processes in LUZP1 knockout cells provides mechanistic insights into the defective assembly of thick ventral stress fibers and the associated cellular contractility abnormalities. Overall, these results significantly contribute to our understanding of the molecular mechanism involved in actomyosin bundle formation and highlight the essential role of LUZP1 in this process.