Abstract In eukaryotes, intracellular physicochemical properties like macromolecular crowding and cytoplasmic viscoelasticity influence key processes such as metabolic activities, molecular diffusion, and protein folding. However, mapping crowding and viscoelasticity in living cells remains challenging. One approach uses passive rheology in which diffusion of exogenous fluorescent particles internalised in cells is tracked and physicochemical properties inferred from derived mean square displacement relations. Recently, the crGE2.3 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensor was developed to quantify crowding in cells, though it is unclear how this readout depends on viscoelasticity and the molecular weight of the crowder. Here, we present correlative, multidimensional data to explore diffusion and molecular crowding characteristics of molecular crowding agents using super-resolved fluorescence microscopy and ensemble time-resolved spectroscopy. We firstly characterise in vitro and then apply these insights to live cells of budding yeast Saccharomyces cerevisiae . It is to our knowledge the first time this has been attempted. We demonstrate that these are usable both in vitro and in the case of endogenously expressed sensors in live cells. Finally, we present a method to internalise fluorescent beads as in situ viscoelasticity markers in the cytoplasm of live yeast cells, and discuss limitations of this approach including impairment of cellular function.

The structure, dynamics and function of lipid vesicles are heavily influenced by a range of physical forces, local microenvironmental effects and interactions with perturbative molecules, including detergents. Detergent-induced membrane interactions - critical for a wide range of applications including protein extraction and virus inactivation - varies in magnitude according to the detergent type and membrane composition, but the underlying mechanistic details remain largely under explored. Open questions relate to the precise molecular-level pathway of detergent-induced vesicle fusion, the nature of the fusion products, the influence of modulatory factors, and whether fusion states can be controllably harnessed for bionanotechnology. By using a lipid mixing assay based on Förster resonance energy transfer (FRET), and single-vesicle characterization approaches to assess vesicle heterogeneity, we identify that both freely-diffusing and surface-tethered sub-micron sized vesicles are induced to fuse by the widely used non-ionic detergent Triton-X 100. We demonstrate that the fusion process is a multi-step mechanism, characterized by discrete values of FRET efficiency between membrane-embedded donor and acceptor fluorophores, and involves vesicle docking, hemi-fusion and full lipid mixing, even at sub-solubilizing detergent concentrations. We present evidence that the fusion process is regulated by environmental factors including membrane composition and phase, and we dissect the kinetics of vesicle fusion in contact with solid surfaces using a label free quartz-crystal microbalance with dissipation monitoring approach. The presented strategies are likely to be applicable beyond the vesicle sizes and compositions studied here, and not only provide mechanistic insight into the multifaceted dynamics of vesicle fusion but also have implications for a wide range of biotechnological applications including drug delivery, sensor development, surfactant sensing, biomimetic formation, and microfluidics, where transport and manipulation of encapsulated cargo is essential.

Abstract The interaction of Tween-20 with lipid membranes is crucial for a number of biotechnological applications including viral inactivation and membrane protein extraction, but the underlying mechanistic details have remained elusive. Evidence from ensemble assays supports a global model of Tween-20 induced membrane disruption that broadly encompasses association of the surfactant with the membrane surface, membrane fragmentation and the release of mixed micelles to solution, but whether this process involves intermediate and dynamic transitions between regimes is an open question. In search of the mechanistic origins of membrane disruption, increasing focus is put on identifying Tween-20 interactions with highly controllable model membranes. In light of this, and to unveil quantitative mechanistic details, we employed highly interdisciplinary biophysical approaches, including quartz-crystal microbalance with dissipation monitoring, steady-state and time-resolved fluorescence and FRET spectroscopy, dynamic light scattering, fluorescence correlation spectroscopy, wide-field single-vesicle imaging and scanning electron microscopy, to interrogate the interactions between Tween-20 and both freely-diffusing and surface-immobilized model-membrane vesicles. Using ultrasensitive sensing approaches, we discovered that Tween-20 leads to a stepwise and phase-dependent structural remodelling of sub-micron sized vesicles that includes permeabilization and swelling, even at detergent concentrations below the critical micellar concentration. These insights into the structural perturbation of lipid vesicles upon Tween-20 interaction highlight the impact on vesicle conformation prior to complete solubilization, and the tools presented may have general relevance for probing the interaction between lipid vesicles and a wide variety of disruptive agents.

Abstract Lipid vesicles are valuable mesoscale molecular confinement vessels for studying membrane mechanics and lipid-protein interactions, and they have found utility among bio-inspired technologies including drug delivery vehicles. While vesicle morphology can be modified by changing the lipid composition and introducing fusion or pore-forming proteins and detergents, the influence of extramembrane crowding on vesicle morphology has remained under explored owing to a lack of experimental tools capable of capturing morphological changes on the nanoscale. Here, we use biocompatible polymers to simulate molecular crowding in vitro , and through combinations of FRET spectroscopy, lifetime analysis, dynamic light scattering and single-vesicle imaging, we characterize how crowding regulates vesicle morphology. We show that both freely-diffusing and surface-tethered vesicles fluorescently tagged with the DiI and DiD FRET pair undergo compaction in response to modest concentrations of sorbitol, polyethylene glycol and Ficoll. A striking observation is that sorbitol results in irreversible compaction, whereas the influence of high molecular weight PEG-based crowders was found to be reversible. Regulation of molecular crowding allows for precise control of vesicle architecture in vitro , with vast implications for drug delivery and vesicle trafficking systems. Furthermore, our observations of vesicle compaction may also serve to act as a mechanosensitive readout of extramembrane crowding.

Many enzymes undergo conformational changes when bound to a substrate, however, structural plasticity in substrate-free enzymes, and potential associated benefits, is poorly understood. Here, we study the structural dynamics of Rep, an accessory helicase which undergoes conformational transitions in performing crucial roles in bacterial DNA replication, repair and recombination. Using time-correlated single-photon counting, fluorescence correlation spectroscopy, rapid single-molecule Förster resonance energy transfer, Anti-Brownian ELectrokinetic trapping and molecular dynamics simulations, we find that free Rep adopts four conformations, revealing that DNA absence confers structural plasticity beyond simple two-state binding. Our fast measurement technologies reveal hitherto hidden transient intermediate transitions between open and closed conformations, several of which are strongly dependent on sodium chloride concentration. Our findings support an alternative binding model for accessory helicases that utilises conformational plasticity to explore a multiplicity of structures whose landscape can be "tuned" by the ionic environment prior to locking-in upon DNA binding.

Abstract Membrane solubilization by sodium dodecyl sulfate (SDS) is indispensable for many established biotech-nological applications, including viral inactivation and protein extraction. Although the ensemble thermo-dynamics have been thoroughly explored, the underlying molecular dynamics have remained inaccessible, owing to major limitations of traditional measurement tools. Here, we integrate multiple advanced biophysical approaches to gain multi-angle insight into the time-dependence and fundamental kinetic steps associated with the solubilization of single sub-micron sized vesicles in response to SDS. We find that the accumulation of SDS molecules on in-tact vesicles triggers biphasic solubilization kinetics comprising an initial vesicle expansion event followed by rapid lipid loss and micellization. Our findings support a general mechanism of detergent-induced membrane solubilization and we expect the framework of correlative biophysical technologies presented here will form a general platform for elucidating the complex kinetics of membrane perturbation induced by a wide variety of surfactants and disrupting agents.