Abstract A localized transcriptome at the synapse facilitates synapse-, stimulus-, and transcript-specific synthesis of the local proteome in response to neuronal activity. While enzyme-mediated mRNA modifications have been shown to regulate cellular mRNA turnover and translation, the role of these modifications in regulating synaptic RNA has not been studied. We established low-input m 6 A-seq of synaptosomal RNA to determine the chemically modified local transcriptome in healthy adult mouse forebrain and identified 4,329 selectively enriched m 6 A RNA peaks in 2,987 genes, which we refer to as the synaptic m 6 A epitranscriptome (SME). SME is functionally enriched in synthesis and modulation of tripartite synapses, and in pathways implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric diseases. Interrupting m 6 A-mediated regulation via knockdown of reader YTHDF1 in hippocampal neurons alters expression of SME member Apc , and causes synaptic malfunctions manifesting immature spine morphology and dampened excitatory synaptic transmission concomitant with decreased PSD-95 clustering and GluA1 surface expression. Our findings indicate that chemical modifications of synaptic mRNAs critically contribute to synaptic function.

Abstract To date, over 100 different chemical modifications to RNA have been identified. Collectively known as the epitranscriptome, these modifications function to regulate RNA stability and as such, represent another mechanistic layer of post-transcriptional gene regulation. N6-methyladenosine (m6A) is the most common RNA modification in the mammalian brain and has been implicated in a number of processes relevant to neurodevelopment, brain function and behaviour. Here, following brief descriptions on epitranscriptomic mechanisms, we will review the literature on the potential functions of the m6A-methylome in fine-tuning gene expression which include prescribing localisation of transcripts in distal compartments as well as interactions with microRNAs and long non-coding RNAs. We will then discuss findings from rodent and human studies for stress-induced disorders - major depression and post-traumatic stress disorder – which support a hypothesis for a dysregulation of the m6A-methylome and the m6A-machinery in the pathophysiology. To support this, we have included a bioinformatic analysis of publicly available single-cell RNA-sequencing and bulk transcriptomics datasets which suggests an altered m6A-methylome as a consequence of dysregulated cell- and regionally-specific expression of key enzymes involved in the ‘writing, reading and erasing’ of m6A. We hope this review will generate further interest in the field of epitranscriptomics, opening up new lines of research into its involvement in psychiatric disorders.

Summary Cellular global translation is often measured using ribosome profiling or quantitative mass spectrometry, but these methods do not provide direct information at the level of elongating nascent polypeptide chains (NPCs) and associated co-translational events. Here we describe pSNAP, a method for proteome-wide profiling of NPCs by affinity enrichment of puromycin- and stable isotope-labeled polypeptides. pSNAP does not require ribosome purification and/or chemical labeling, and captures bona fide NPCs that characteristically exhibit protein N-terminus-biased positions. We applied pSNAP to evaluate the effect of silmitasertib, a potential molecular therapy for cancer, and revealed acute translational repression through casein kinase II and mTOR pathways. We also characterized modifications on NPCs and demonstrated that the combination of different types of modifications, such as acetylation and phosphorylation in the N-terminal region of histone H1.5, can modulate interactions with ribosome-associated factors. Thus, pSNAP provides a framework for dissecting co-translational regulations on a proteome-wide scale.

Abstract Although the function of tRNA in translational process is well established, it remains controversial whether tRNA abundance is tightly associated with translational efficiency (TE) in mammals. For example, how critically the expression of tRNAs contributes to the establishment of tissue-specific proteomes in mammals has not been well addressed. Here, we measured both tRNA expression using DM-tRNA-seq and ribosome-associated mRNAs in the brain, heart, and testis of RiboTag mice. Remarkable variation in the expression of tRNA isodecoders was observed among the different tissues. When the statistical effect of isodecoder-grouping on reducing variations is considered through permutating the anticodons, we observed an expected reduction in the tissue-variations of anticodon expression, an unexpected smaller variation of anticodon usage bias , and an unexpected larger variation of tRNA isotype expression. Regardless whether or not they share the same anticodons, isotypes encoding the same amino acids are co-expressed across different tissues. Based on the tRNA expression and TE computed from RiboTag-seq, we find that the tRNA adaptation index (tAI) values and TE are significantly correlated in the same tissues but not among tissues; tRNAs and the amino acid compositions of translating peptides are positively correlated in the same tissues but not between tissues. We therefore hypothesize that the tissue-specific expression of tRNAs might be related to post-transcriptional mechanisms, such as aminoacylation, modification, and tRNA-derived small RNAs (tsRNAs). This study provides a resource for tRNA and translation studies to gain novel insights into the dynamics of tRNAs and their role in translational regulation.

Abstract Spatial regulations of mRNA translation are central to cellular functions and relies on numerous complex processes. Biomimetic approaches could bypass the endogenous complex processes, improve our comprehension, and allow for controlling local translation regulations and functions. However, the causality between localizing translation and nascent protein function remains elusive. Here, we develop a novel nanoparticle-based strategy to magnetically control mRNA spatial patterns in mammalian cell extracts and investigate how local translation impacts nascent protein localization and function. By monitoring translation on magnetically localized mRNAs, we show that mRNA-nanoparticle operates as a source for the continuous production of proteins from defined positions. By applying magnetic localization of mRNAs coding for Actin Binding Proteins, we trigger the local formation of actin cytoskeleton and identify minimal requirements for spatial control of actin filament network. In addition, our bottom-up approach identifies a novel role of mRNA as translation-coupled scaffold for nascent N-terminal protein domain functions. Our approach will serve as a novel platform for regulating mRNA localization and investigating a functional role of nascent protein domains during translation.

We introduce starTracer, a novel R package designed to enhance the specificity and efficiency of marker gene identification in single-cell RNA-seq data analysis. The package consists of two primary functional modules: "searchMarker" and "filterMarker". The "searchMarker" module, operating as an independent pipeline, exhibits superior flexibility by accepting a variety of input file types. Its primary output is a marker gene matrix, where genes are sorted by their potential to function as cluster-specific markers, with those exhibiting the greatest potential positioned at the top of the matrix for each respective cluster. In contrast, the "filterMarker" module is designed as a complementary pipeline to the Seurat "FindAllMarkers" function, providing a more accurate marker gene list for each cluster in conjunction with Seurat results. Benchmark analyses demonstrate that starTracer not only achieves excellent specificity in identifying marker genes compared to Seurat but also significantly surpasses it in processing speed. Impressively, the speed improvement ranges by 1~2 orders of magnitude compared to Seurat, as observed across three independent datasets. It is worth noting that starTracer exhibits increasing speed improvement with larger data volumes. It also excels in identifying markers in smaller clusters. Furthermore, the "filterMarker" reordering process considerably enhances Seurat9s marker matrix specificity. These advantages solidify starTracer as an invaluable tool for researchers working with single-cell RNA-seq data, merging robust accuracy with exceptional speed.

Abstract Building and maintaining neuronal networks and cognitive functions require mRNA localization and regulated protein synthesis in neurons. RNA modification N 6 -methyl-adenosine (m 6 A) has recently been shown in axonal and synaptically localized mRNAs whose local activity is required for axon growth, synaptogenesis, and neuronal plasticity. However, no cellular pathways engaging local epitranscriptomic modulation are known to underlie these post-mitotic neuronal functions. Now we report that cytoplasmic m 6 A reader YTHDF1 is enriched in neurons and required for axonal, dendritic, and spine development. We show that m 6 A and YTHDF1 are part of a microtubule plus-end associated RNA granule that contains extensive networks of mRNAs organized by autism risk gene adenomatous polyposis coli (APC). Disrupting m 6 A signals by knocking down methyltransferase METTL14 or YTHDF1, or overexpressing autism or schizophrenia-associated missense mutations I311V or S399L in human METTL14, reduce expression of APC granule and tubulin, disrupt microtubule assembly and function. These results reveal a novel neuronal subcellular locus for epitranscriptomic regulation to promote post-mitotic neurodevelopment.

Abstract Skeletal muscle regeneration requires extracellular matrix (ECM) remodeling including an acute and transient breakdown of collagen that produces gelatin. However, the physiological function of such a remodeling process on muscle tissue repair is unclear. Here we elaborate on a bi-phasic effect of gelatin in skeletal muscle regeneration, mediated by hormetic effects of reactive oxygen species (ROS). Low-dose gelatin stimulates ROS production from NADPH oxidase 2 (NOX2) and simultaneously upregulates antioxidant system for cellular defense, reminiscent of the adaptive compensatory process during mild stress. This response triggers the release of myokine IL-6 which stimulates myogenesis and facilitates muscle regeneration. By contrast, high-dose gelatin stimulates ROS overproduction from NOX2 and mitochondrial chain complex, and ROS accumulation by suppressing antioxidant system, triggering release of TNFα, which inhibits myogenesis and regeneration. Our findings reveal gelatin-ROS-IL-6/TNFα signaling cascades underlying a hormetic response of myogenic cells to gelatin.