Circular dichroism spectroscopy is a widely used technique to analyze the secondary structure of proteins in solution. Predictive methods use the circular dichroism spectra from proteins of known tertiary structure to assess the secondary structure contents of a protein with unknown structure given its circular dichroism spectrum. We developed K2D2, a method with an associated web server to estimate protein secondary structure from circular dichroism spectra. The method uses a self-organized map of spectra from proteins with known structure to deduce a map of protein secondary structure that is used to do the predictions. The K2D2 server is publicly accessible at http://www.ogic.ca/projects/k2d2/ . It accepts as input a circular dichroism spectrum and outputs the estimated secondary structure content (alpha-helix and beta-strand) of the corresponding protein, as well as an estimated measure of error.

Tay-Sachs and Sandhoff diseases (GM2 gangliosidosis) are autosomal recessive disorders of lysosomal function that cause fatal and progressive neurodegeneration in infants and young children. Impaired hydrolysis catalysed by β-hexosaminidase A (HexA) leads to the accumulation of its specific substrate, GM2 ganglioside, in neuronal lysosomes. Despite the development of a florid storage phenotype, the role of autophagy and its regulation by the mammalian target of rapamycin (mTOR) has yet to be explored in the neuropathogenesis. Accordingly, we investigated the effects on autophagy and lysosomal integrity using skin fibroblasts obtained from patients with Tay-Sachs and Sandhoff diseases. Pathological autophagosomes, with enhanced expression of the p62/SQSTM1 protein, suggested impaired autophagic flux, an abnormality confirmed by electron microscopy and biochemical studies revealing the accelerated release of mature cathepsins and HexA into the cytosol, indicating increased lysosomal permeability. GM2 fibroblasts showed inappropriately diminished mTOR signalling with reduced basal mTOR activity. Accordingly, provision of a positive nutrient signal by L-arginine supplementation partially restored mTOR activity and ameliorated the cytopathological abnormalities - and immediately suggests an avenue for therapeutic exploration in this cruel disease. We also contend that the expression of autophagy/lysosome/mTOR-associated molecules may prove useful peripheral biomarkers for facile monitoring of systemic treatment of GM2 gangliosidosis and neurodegenerative disorders that affect the lysosomal function and disrupt autophagy

Abstract Antimicrobial resistance is widely recognized as a serious global public health problem. To combat this threat, a thorough understanding of bacterial genomes is necessary. The current wide availability of bacterial genomes provides us with an in-depth understanding of the great variability of dispensable genes and their relationship with antimicrobials. Some of these accessory genes are those involved in CRISPR-Cas systems, which are acquired immunity systems that are present in part of bacterial genomes. They prevent viral infections through small DNA fragments called spacers. But the vast majority of these spacers have not yet been associated with the virus they recognize, and this has been named CRISPR dark matter. By analyzing the spacers of tens of thousands of genomes from six bacterial species highly resistant to antibiotics, we have been able to reduce the CRISPR dark matter from 80-90% to as low as 15% in some of the species. In addition, we have observed that, when a genome presents CRISPR-Cas systems, this is accompanied by particular collections of membrane proteins. Our results suggest that when a bacterium presents membrane proteins that make it compete better in its environment, and these proteins are in turn receptors for specific phages, it would be forced to acquire CRISPR-Cas immunity systems to avoid infection by these phages.

The current genomics era is bringing an unprecedented growth in the amount of gene expression data, only comparable to the exponential growth of sequences in databases during the last decades. This data now allows the design of secondary analyses that take advantage of this information to create new knowledge through specific computational approaches. One of these feasible analyses is the evaluation of the expression level for a gene through a series of different conditions or cell types. Based on this idea, we have developed ASACO, Automatic and Serial Analysis of CO-expression, which performs expression profiles for a given gene along hundreds of normalized and heterogeneous transcriptomics experiments and discover other genes that show either a similar or an inverse behavior. It might help to discover co-regulated genes, and even common transcriptional regulators in any biological model, including human diseases or microbial infections. The present SARS-CoV-2 pandemic is an opportunity to test this novel approach due to the wealth of data that is being generated, which could be used for validating results. In addition, new cell mechanisms identified could become new therapeutic targets. Thus, we have identified 35 host factors in the literature putatively involved in the infectious cycle of SARS-CoV and/or SARS-CoV-2 and searched for genes tightly co-expressed with them. We have found around 1900 co-expressed genes whose assigned functions are strongly related to viral cycles. Moreover, this set of genes heavily overlap with those identified by former laboratory high-throughput screenings (with p-value near 0). Some of these genes aim to cellular structures such as the stress granules, which could be essential for the virus replication and thereby could constitute potential targets in the current fight against the virus. Additionally, our results reveal a series of common transcription regulators, involved in immune and inflammatory responses, that might be key virus targets to induce the coordinated expression of SARS-CoV-2 host factors. All of this proves that ASACO can discover gene co-regulation networks with potential for proposing new genes, pathways and regulators participating in particular biological systems.ASACO identifies regulatory associations of genes using public transcriptomics data.ASACO highlights new cell functions likely involved in the infection of coronavirus.Comparison with high-throughput screenings validates candidates proposed by ASACO.Genes co-expressed with host's genes used by SARS-CoV-2 are related to stress granules.

ABSTRACT The requirement for Cas nucleases to recognize a specific PAM is a major restriction for genome editing. SpCas9 variants SpG and SpRY, recognizing NGN and NRN PAM, respectively, have contributed to increase the number of editable genomic sites in cell cultures and plants. However, their use has not been demonstrated in animals. We have characterized and optimized the activity of SpG and SpRY in zebrafish and C. elegans . Delivered as mRNA-gRNA or ribonucleoprotein (RNP) complexes, SpG and SpRY were able to induce mutations in vivo , albeit at a lower rate than SpCas9 in equivalent formulations. This lower activity was overcome by optimizing mRNA-gRNA or RNP concentration, leading to efficient mutagenesis at regions inaccessible to SpCas9. We also found that the CRISPRscan algorithm can predict SpG and SpRY activity in vivo . Finally, we applied SpG and SpRY to generate knock-ins by homology-directed repair. Altogether, our results expand the CRISPR-Cas targeting genomic landscape in animals.

Acinetobacter baumannii is an opportunistic nosocomial pathogen with high morbidity and mortality rates. Current treatment options for this pathogen are limited due to its increasing resistance to last-resort antibiotics. Despite A . baumannii’s leading position in the World Health Organisations priority pathogens list, little is known about its virulence regulation. Through a high-throughput screening approach to identify novel biofilm regulators, we identified a previously uncharacterised predicted adenylate cyclase (AC), CavA, as a central regulator of this phenotype. cAMP is a crucial mediator of various aspects of bacterial physiology in other species but information about its role in A . baumannii is limited. We confirm that CavA AC is functional and synthesizes cAMP in A . baumannii . Using dRNA-seq, we verify that CavA is a negative biofilm formation regulator affecting Csu pili and exopolysaccharide production. We demonstrate for the first time that in A . baumannii , cAMP is atop of a hierarchical signalling cascade controlling inter- and intrabacterial signalling by modulating quorum sensing and cyclic di-GMP systems, ultimately governing virulence in vivo and adaptive antibiotic resistance. In contrast to the well-established paradigm in other bacteria where cAMP and cyclic di-GMP levels are inversely regulated, we uncover that the levels of these second messengers are directly proportional in A . baumannii . Overall, this study uncovers the central role of CavA and cAMP in the pathogenic success of A . baumannii and highlights this signalling cascade as a high potential target for novel therapeutic development.

CRISPR-Cas systems are acquired immunity systems of bacteria and archaea that prevent infection by phages and other mobile genetic elements. It is currently known that this defense system has also been co-opted by viruses. These viruses could use CRISPR-Cas systems to compete against other rival viruses. We have discovered a virus in the bacterium Acinetobacter baumannii that incorporates a CRISPR-Cas system into an integration hotspot of the host genome. Once integrated, this CRISPR-Cas system could prevent the infection of the most frequent viruses in this bacterial species, especially one that competes with the CRISPR-Cas system itself for the same integration site. This latter virus is prevalent in strains of the species belonging to the so-called Global Clone 2, which causes the most frequent outbreaks worldwide. According to the World Health Organisation, A. baumannii is a top-priority opportunistic pathogen with an increasing number of isolates emerging as multi-drug resistant. The knowledge about this new viral warfare using CRISPR-Cas systems, which are known to limit the entry of antibiotic resistance genes into bacteria, could be useful in the fight against the infections they cause.