Reversible epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is central to tissue development, epithelial stemness, and cancer metastasis. While many regulatory elements have been identified to induce EMT, the complex process underlying such cellular plasticity remains poorly understood. Utilizing a systems biology approach integrating modeling and experiments, we found multiple intermediate states contributing to EMT and that the robustness of the transitions is modulated by transcriptional factor Ovol2. In particular, we obtained evidence for a mutual inhibition relationship between Ovol2 and EMT inducer Zeb1, and observed that adding this regulation generates a novel four-state system consisting of two distinct intermediate phenotypes that differ in differentiation propensities and are favored in different environmental conditions. We identified epithelial cells that naturally exist in an intermediate state with bidirectional differentiation potential, and found the balance between EMT-promoting and -inhibiting factors to be critical in achieving and selecting between intermediate states. Our analysis suggests a new design principle in controlling cellular plasticity through multiple intermediate cell fates and underscores the critical involvement of Ovol2 and its associated molecular regulations.

Abstract Large-scale transcriptome data, such as single-cell RNA-sequencing data, have provided unprecedented resources for studying biological processes at the systems level. Numerous dimensionality reduction methods have been developed to visualize and analyze these transcriptome data. In addition, several existing methods allow inference of functional variations among samples using gene sets with known biological functions. However, it remains challenging to analyze transcriptomes with reduced dimensions that are interpretable in terms of dimensions’ directionalities, transferrable to new data, and directly expose the contribution of individual genes. In this study, we used gene set non-negative principal component analysis (gsPCA) and non-negative matrix factorization (gsNMF) to analyze large-scale transcriptome datasets. We found that these methods provide low-dimensional information about the progression of biological processes in a quantitative manner, and their performances are comparable to existing functional variation analysis methods in terms of distinguishing multiple cell states and samples from multiple conditions. Remarkably, upon training with a subset of data, these methods allow predictions of locations in the functional space using data from experimental conditions that are not exposed to the models. Specifically, our models predicted the extent of progression and reversion for cells in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) continuum. These methods revealed conserved EMT program among multiple types of single cells and tumor samples. Finally, we demonstrate this approach is broadly applicable to data and gene sets beyond EMT and provide several recommendations on the choice between the two linear methods and the optimal algorithmic parameters. Our methods show that simple constrained matrix decomposition can produce to low-dimensional information in functionally interpretable and transferrable space, and can be widely useful for analyzing large-scale transcriptome data.

Abstract Rett syndrome is characterized by an early period of typical development and then, regression of learned motor and speech skills in girls. Loss of MECP2 protein is thought to cause Rett syndrome phenotypes. The specific underlying mechanisms from typical developmental trajectory to regression features throughout life are unclear. Lack of established timelines to study the molecular, cellular, and behavioral features of regression in female mouse models is a major contributing factor. Due to random X-chromosome inactivation, female patients with Rett syndrome and female mouse models for Rett syndrome ( Mecp2 Heterozygous , Het) express a functional copy of wild-type MECP2 protein in approximately half of all cells. As MECP2 expression is regulated during early postnatal development and experience, we characterized the expression of wild-type MECP2 in the primary somatosensory cortex of female Het mice. Here, we report increased MECP2 levels in non-parvalbumin-positive neurons of 6-week-old adolescent Het relative to age-matched wild-type controls, while also displaying similar levels of perineuronal net expression, mild tactile sensory perception deficits, and efficient pup retrieval behavior. In contrast, 12-week-old adult Het express MECP2 at levels similar to age-matched wild-type mice, show increased perineuronal net expression in the cortex, and display significant tactile sensory perception deficits. Thus, we have identified a set of behavioral metrics and the cellular substrates to study regression during a specific time in the female Het mouse model, which coincide with changes in wild-type MECP2 expression. We speculate that the precocious increase in MECP2 expression within specific cell types of adolescent Het may provide compensatory benefits at the behavioral level, while the inability to further increase MECP2 levels leads to regressive behavioral phenotypes over time.

Abstract Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a cellular process involved in development and disease progression. Intermediate EMT states were observed in tumors and fibrotic tissues, but previous in vitro studies focused on time-dependent responses with single doses of signals; it was unclear whether single-cell transcriptomes support stable intermediates observed in diseases. Here, we performed single-cell RNA-sequencing with human mammary epithelial cells treated with multiple doses of TGF-β. We found that dose-dependent EMT harbors multiple intermediate states at nearly steady state. Comparisons of dose- and time-dependent EMT transcriptomes revealed that the dose-dependent data enable higher sensitivity to detect genes associated EMT. We identified cell clusters unique to time-dependent EMT, reflecting cells en route to stable states. Combining dose- and time-dependent cell clusters gave rise to accurate prognosis for cancer patients. Our transcriptomic data and analyses uncover a stable EMT continuum at the single-cell resolution, and complementary information of two types of single-cell experiments.

ABSTRACT The shoot apical meristem (SAM) gives rise to the aboveground organs of plants. The size of the SAM is relatively constant due to the balance between stem cell replenishment and cell recruitment into new organs. In angiosperms, the transcription factor WUSCHEL (WUS) promotes stem cell proliferation in the central zone of the SAM. WUS forms a negative feedback loop with a signaling pathway activated by CLAVATA3 (CLV3). In the periphery of the SAM, the ERECTA family receptors (ERfs) constrain WUS and CLV3 expression. Here, we show that four ligands of ERfs redundantly inhibit the expression of these two genes. Transcriptome analysis confirmed that WUS and CLV3 are the main targets of ERf signaling and uncovered new ones. Analysis of promoter reporters indicated that the WUS expression domain mostly overlaps with the CLV3 domain and does not shift along the apical-basal axis in clv3 mutants. Our three-dimensional mathematical model captured gene expression distributions at the single-cell level under various perturbed conditions. Based on our findings, CLV3 regulates cellular levels of WUS mostly through autocrine signaling, and ERfs regulate the spatial expression of WUS, preventing its encroachment into the peripheral zone.

Abstract Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a change in cell shape and mobility that occurs during normal development or cancer metastasis. Multiple intermediate EMT states reflecting hybrid epithelial and mesenchymal phenotypes were observed in various physiological and pathological conditions. Previous theoretical models explaining the intermediate EMT states rely on multiple regulatory loops involving transcriptional feedback. These models produce three or four attractors with a given set of rate constants, which is incompatible with experimentally observed non-genetic heterogeneity reflecting a continuum-like EMT spectrum. EMT is regulated by many microRNAs that typically bind transcripts of EMT-related genes via multiple binding sites. It was unclear whether post-transcriptional regulations associated with the microRNA binding sites alone can stabilize intermediate EMT states. Here, we used models describing the post-transcriptional regulations with elementary reaction networks, finding that cooperative RNA degradation via multiple microRNA binding sites can generate four-attractor systems without transcriptional feedback. We identified many specific, experimentally supported instances of network structures predicted to permit intermediate EMT states. Furthermore, transcriptional feedback and the newly identified intermediates-enabling circuits can be combined to produce even more intermediate EMT states in both modular and emergent manners. Finally, multisite-mediated cooperative RNA degradation can increase the distribution of gene expression in the EMT spectrum and support the phenotypic continuum without the need of higher noise. Our work reveals a previously unknown role of cooperative RNA degradation and microRNA in EMT, providing a theoretical framework that can help to bridge the gap between mechanistic models and single-cell experiments.

Breast cancer cells exhibit organotropism during metastasis, showing preferential homing to certain organs such as bone, lung, liver, and brain. One potential explanation for this organotropic behavior is that cancer cells gain properties that enable thriving in certain microenvironments. Such specific metastatic traits may arise from gene regulation at the primary tumor site. Spatial genome organization plays a crucial role in oncogenic transformation and progression, but the extent to which chromosome architecture contributes to organ-specific metastatic traits is unclear. This work characterizes chromosome architecture changes associated with organotropic metastatic traits. By comparing a collection of genomic data from different subtypes of localized and lung metastatic breast cancer cells with both normal and cancerous lung cells, we find important trends of genomic reorganization. The most striking differences in 3D genome compartments segregate cell types according to their epithelial vs. mesenchymal status. This EMT compartment signature occurs at genomic regions distinct from transcription-defined EMT signatures, suggesting a separate layer of regulation. Specifically querying organotropism, we find 3D genome changes consistent with adaptations needed to survive in a new microenvironment, with lung metastatic breast cells exhibiting compartment switch signatures that shift the genome architecture to a lung cell-like conformation and brain metastatic prostate cancer cells showing compartment shifts toward a brain-like state. TCGA patient data reveals gene expression changes concordant with these organ-permissive compartment changes. These results suggest that genome architecture provides an additional level of cell fate specification informing organotropism and enabling survival at the metastatic site.

Abstract Small cell lung cancer (SCLC) is an aggressive cancer recalcitrant to treatment, arising predominantly from epithelial pulmonary neuroendocrine (NE) cells. Intra-tumor heterogeneity plays critical roles in SCLC disease progression, metastasis and treatment resistance. At least five transcriptional SCLC NE and non-NE cell subtypes were recently defined by gene expression signatures. Transition from NE to non-NE cell states and cooperation between subtypes within a tumor likely contribute to SCLC progression by mechanisms of adaptation to perturbations. Therefore, gene regulatory programs distinguishing SCLC subtypes or promoting transitions are of great interest. Here, we systematically analyze the relationship between SCLC NE/non-NE transition and epithelial to mesenchymal transition (EMT)—a well-studied cellular process contributing to cancer invasiveness and resistance—using multiple transcriptome datasets from SCLC mouse tumor models, human cancer cell lines and tumor samples. The NE SCLC-A2 subtype maps to the epithelial state. In contrast, SCLC-A and SCLC-N (NE) map to a mesenchymal state (M1) that is distinct from the non-NE mesenchymal state (M2). The correspondence between SCLC subtypes and the EMT program paves the way for further work to understand gene regulatory mechanisms of SCLC tumor plasticity with applicability to other cancer types.

The shoot apical meristem (SAM) gives rise to above-ground organs. The size of the SAM is relatively constant due to the balance of stem cell replenishment versus cell recruitment into developing organs. In angiosperms, the transcription factor WUSCHEL (WUS) promotes stem cell identity in the central zone of the SAM. WUS forms a negative feedback loop with a signaling pathway activated by CLAVATA3 (CLV3). In the periphery of the SAM, the ERECTA family (ERf) receptors promote cell differentiation and constrain the expression of WUS and CLV3. Here, we show that four ligands of ERfs redundantly inhibit CLV3 and WUS expression. Transcriptome analysis confirmed that WUS and CLV3 are the main targets of ERf signaling and uncovered several new ones. Analysis of promoter reporters indicated that in the vegetative meristem, the WUS expression domain mostly overlapped with the CLV3 domain and did not shift along the apical-basal axis in clv3. A 3D mathematical model reproduced the experimentally observed CLV3 and WUS expression patterns with fewer assumptions than earlier models. Based on these findings, we propose that CLV3 regulates cellular levels of WUS expression through autocrine signaling, while ERfs regulate WUS spatial expression, preventing its encroachment into the peripheral zone.