BACKGROUND: Transverse (t)-tubules drive the rapid and synchronous Ca 2+ rise in cardiac myocytes. The virtual complete atrial t-tubule loss in heart failure (HF) decreases Ca 2+ release. It is unknown if or how atrial t-tubules can be restored and how this affects systolic Ca 2+ . METHODS: HF was induced in sheep by rapid ventricular pacing and recovered following termination of rapid pacing. Serial block-face scanning electron microscopy and confocal imaging were used to study t-tubule ultrastructure. Function was assessed using patch clamp, Ca 2+ , and confocal imaging. Candidate proteins involved in atrial t-tubule recovery were identified by western blot and expressed in rat neonatal ventricular myocytes to determine if they altered t-tubule structure. RESULTS: Atrial t-tubules were lost in HF but reappeared following recovery from HF. Recovered t-tubules were disordered, adopting distinct morphologies with increased t-tubule length and branching. T-tubule disorder was associated with mitochondrial disorder. Recovered t-tubules were functional, triggering Ca 2+ release in the cell interior. Systolic Ca 2+ , I Ca-L , sarcoplasmic reticulum Ca 2+ content, and sarcoendoplasmic reticulum Ca 2+ ATPase function were restored following recovery from HF. Confocal microscopy showed fragmentation of ryanodine receptor staining and movement away from the z-line in HF, which was reversed following recovery from HF. Acute detubulation, to remove recovered t-tubules, confirmed their key role in restoration of the systolic Ca 2+ transient, the rate of Ca 2+ removal, and the peak L-type Ca 2+ current. The abundance of telethonin and myotubularin decreased during HF and increased during recovery. Transfection with these proteins altered the density and structure of tubules in neonatal myocytes. Myotubularin had a greater effect, increasing tubule length and branching, replicating that seen in the recovery atria. CONCLUSIONS: We show that recovery from HF restores atrial t-tubules, and this promotes recovery of I Ca-L , sarcoplasmic reticulum Ca 2+ content, and systolic Ca 2+ . We demonstrate an important role for myotubularin in t-tubule restoration. Our findings reveal a new and viable therapeutic strategy.

Abstract Transverse (t)-tubules ensure a uniform rise in calcium (Ca 2+ ) and thus contraction in cardiac cells. Though more extensively studied in the ventricle, t-tubules also play a key role in the atria of large mammals, such as human, and their loss in heart failure is associated with impaired Ca 2+ release and thus contractility. T-tubule restoration is therefore an ideal therapeutic target but the process of t-tubule formation is not understood. The aim of this study was to determine how t-tubules develop in the healthy atria and the impact this has on Ca 2+ handling. Postnatal development was assessed in sheep from newborn through to adulthood. Atrial t-tubules were present at birth in the sheep atria and increased in density up until 3 months of age. In the latter part of development (3 months to adult) a lack of t-tubule growth but increase in cell width results in t-tubule density decreasing. In the newborn, despite reduced t-tubule density, we found the amplitude of the Ca 2+ transient was maintained and this was associated with increases in the L-type Ca 2+ current ( I Ca-L ) and the Ca 2+ content of the sarcoplasmic reticulum (SR). We suggest these changes are sufficient to overcome the elevated cytosolic Ca 2+ buffering in the newborn and the decreased t-tubule density. We have shown the neonate atria is highly specialised to negate reduced central Ca 2+ release through enhanced surface I Ca-L and SR load. This maintains atrial function despite immature t-tubules highlighting important differences in Ca 2+ handling in the newborn and heart failure atria where t-tubules are sparse.

Abstract Transverse (t)-tubules drive the rapid and synchronous Ca 2+ rise in cardiac myocytes. The virtual complete loss of atrial t-tubules in heart failure (HF) decreases Ca 2+ release. It is unknown if or how atrial t-tubules can be restored and if restored t-tubules are functional. Sheep were tachypaced to induce HF and recovered when pacing was stopped. Serial block face Scanning Electron Microscopy and confocal imaging were used to understand t-tubule ultrastructure and function. Candidate proteins involved in atrial t-tubule recovery were identified by western blot and causality determined using expression studies. Sheep atrial t-tubules reappeared following recovery from HF. Despite being disordered (branched, longer and longitudinally arranged) recovered t-tubules triggered Ca 2+ release and were associated with restoration of systolic Ca 2+ . Telethonin and myotubularin abundance correlated with t-tubule density and altered the density and structure of BIN1-driven tubules in neonatal myocytes. Myotubularin had a greater effect, increasing tubule length and branching, replicating that seen in the recovery atria. Recovery from HF restores atrial t-tubules and systolic Ca 2+ and myotubularin facilitates this process. Atrial t-tubule restoration could present a new and viable therapeutic strategy. Brief Summary The loss of atrial transverse (t)-tubules and the associated dysfunction in heart failure is reversible and the protein myotubularin plays an important role.