Abstract Group A Streptococcus (GAS) is a Gram-positive bacterial pathogen that causes a wide spectrum of illnesses ranging from pharyngitis and rheumatic fever to more invasive and severe diseases such as necrotizing fasciitis and toxic shock syndrome. Invasive outcomes of GAS infections often result from entry of the bacteria via an open wound into tissue and blood systems. The coagulation cascade serves as an innate defense mechanism that initiates fibrin clots to sequester bacteria and restrict its growth and prevent dissemination into deeper tissues. GAS, especially skin-tropic bacterial strains, utilize the specific virulence factors Plasminogen binding M-protein (PAM) and streptokinase (SK) to manipulate hemostasis and ultimately activate human plasminogen to cause fibrinolysis and escape from the fibrin clot. A major unresolved question regarding this process is to understand the temporal dynamics of how GAS that is enmeshed in a fibrin clot accesses host plasminogen for dissolution of the clot and eventual dissemination. Using fluorescently labeled plasminogen and fibrinogen, we established conditions to observe the process of fibrin clot dissolution by GAS (an AP53 CovR+S-strain) that is sequestered in a fibrin clot using real-time imaging microscopy. We hypothesized that initiation of fibrinolysis by GAS inside a fibrin clot would be determined by the rate of hPg access into the fibrin clot where bacteria are trapped. Our live imaging studies show that GAS trapped inside a fibrin clot, has limited access to hPg; however, at 4.25 h post incubation, when sufficient hPg is accessible to the bacterium, fibrinolysis quickly occurs. If hPg is bound to the bacterial surface prior to being trapped inside a clot, dissolution and bacterial dissemination occurs at a much faster rate of 2.5 h post incubation. During the time which bacteria are trapped in the clot without access to hPg, we did not observe any growth of GAS; however, we demonstrate that the bacteria continue to remain viable inside the fibrin clot. We performed RNA-seq analysis of GAS and the isogenic GAS SK-deficient mutant to understand SK-dependent transcriptional changes during the lag-phase of the GAS bacteria inside the fibrin clot. We observed a dramatic change in the transcription profile of wt GAS inside the fibrin clot over time prior to escape from the fibrin clot (22 gene expression changes at 4h, to 802 gene expression changes at 8h). Furthermore, we also identified gene expression changes that were distinct between wt GAS and the GAS SK-deficient mutant. Our findings reveal for the first time that GAS can engage a latent, growth suspended phase whereby physical structures such as fibrin clots and Neutrophil extracellular traps that immobilize an invading pathogen allow bacteria to remain viable and transcriptionally active for an extended time during host infection. GAS that is trapped in a fibrin clot will therefore enter a state in which the bacteria suspend growth, but remain viable, until sufficient access to hPg allow it to initiate fibrinolysis and escape into surrounding tissues. The viability of GAS while trapped and its readiness to avoid immune defenses allow GAS to act quickly to disseminate when host conditions are more favorable for the bacteria.

Bacteriocins are ribosomally produced antimicrobial peptides that represent an untapped source of promising antibiotic alternatives. However, inherent challenges in isolation and identification of natural bacteriocins in substantial yield have limited their potential use as viable antimicrobial compounds. In this study, we have developed a pipeline for bacteriocin-derived compound design and testing that combines sequence-free prediction of bacteriocins using a machine-learning algorithm and a simple biophysical trait filter to generate minimal 20 amino acid peptide candidates that can be readily synthesized and evaluated for activity. We generated 28,895 total 20-mer peptides and scored them for charge, α-helicity, and hydrophobic moment, allowing us to identify putative peptide sequences with the highest potential for interaction and activity against bacterial membranes. Of those, we selected sixteen sequences for synthesis and further study, and evaluated their antimicrobial, cytotoxic, and hemolytic activities. We show that bacteriocin-based peptides with the overall highest scores for our biophysical parameters exhibited significant antimicrobial activity against E. coli and P. aeruginosa. Our combined method incorporates machine learning and biophysical-based minimal region determination, to create an original approach to rapidly discover novel bacteriocin candidates amenable to rapid synthesis and evaluation for therapeutic use.

Many organisms coordinate to move and colonize over surfaces. Bacteria such as Pseudomonas aeruginosa exhibit such surface motility as a precursor step to forming biofilms. Here we show a group surface motility where small groups of P. aeruginosa use their type IV pili (TFP) appendages over long- distances. Small cell clusters employ their TFP to move multiple cell lengths in fractions of a second and form new multicellular groups. Given the length scale and speed of displacement, cells appear to snap to a new position and then resume their previous behavior. The same long range TFP action also leads to rapid community contraction of sparsely arranged cell clusters. Cluster development and snapping motility does not require exogenous DNA or extracellular polysaccharides.

Background: Staphylococcus aureus (S. aureus) is a major human pathogen owing to its arsenal of virulence factors, as well as its acquisition of multi-antibiotic resistance. Here we report the identification of a Streptolysin S (SLS) like biosynthetic gene cluster in a highly virulent community-acquired methicillin resistant S. aureus (MRSA) isolate, JKD6159. Examination of the SLS-like gene cluster in JKD6159 shows significant homology and gene organization to the SLS-associated biosynthetic gene (sag) cluster responsible for the production of the major hemolysin SLS in Group A Streptococcus. Results: We took a comprehensive approach to elucidating the putative role of the sag gene cluster in JKD6159 by constructing a mutant in which one of the biosynthesis genes (sagB homologue) was deleted in the parent JKD6159 strain. Assays to evaluate bacterial gene regulation, biofilm formation, antimicrobial activity, as well as complete host cell response profile and comparative in vivo infections were conducted. Conclusions: Although no significant phenotypic changes were observed in our assays, we postulate that the SLS-like toxin produced by this strain of S. aureus may be a highly specialized virulence factor utilized in specific environments for selective advantage; studies to better understand the role of this newly discovered virulence factor in S. aureus warrant further investigation.

Monogenetic diseases provide unique opportunity for studying complex, clinical states that underlie neurological severity. Loss of glycine decarboxylase (GLDC) can severely impact neurological development as seen in non-ketotic hyperglycinemia (NKH). NKH is a neuro-metabolic disorder lacking quantitative predictors of disease states. It is characterized by elevation of glycine, seizures and failure to thrive, but glycine reduction often fails to confer neurological benefit, suggesting need for alternate tools to distinguish severe from attenuated disease. A major challenge has been that there are 255 unique disease-causing missense mutations in GLDC, of which 206 remain entirely uncharacterized. Here we report a Multiparametric Mutation Score (MMS) developed by combining in silico predictions of stability, evolutionary conservation and protein interaction models and suitable to assess 251 of 255 mutations. In addition, we created a quantitative scale of clinical disease severity comprising of four major disease domains (seizure, cognitive failure, muscular and motor control and brain-malformation) to comprehensively score patient symptoms identified in 131 clinical reports published over the last 15 years. The resulting patient Clinical Outcomes Scores (COS) were used to optimize the MMS for biological and clinical relevance and yield a patient Weighted Multiparametric Mutation Score (WMMS) that separates severe from attenuated neurological disease (p < 3.5e-5). Our study provides understanding for developing quantitative tools to predict clinical severity of neurological disease and a clinical scale that advances monitoring disease progression needed to evaluate new treatments for NKH.

Abstract Von Hippel-Lindau disease (VHL) is an autosomal dominant rare disease that causes the formation of angiogenic tumors. When functional, pVHL acts as an E3 ubiquitin ligase that negatively regulates hypoxia inducible factor (HIF). Genetic mutations that perturb the structure of pVHL result in dysregulation of HIF, causing a wide array of tumor pathologies including retinal angioma, pheochromocytoma, central nervous system hemangioblastoma, and clear cell renal carcinoma. These VHL-related cancers occur throughout the lifetime of the patient, requiring frequent intervention procedures, such as surgery, to remove the tumors. Although VHL is classified as a rare disease (1 in 39,000 to 1 in 91,000 affected) there is a large heterogeneity in genetic mutations listed for observed pathologies. Understanding how these specific mutations correlate with the myriad of observed pathologies for VHL could provide clinicians insight into the potential severity and onset of disease. Using a set of 285 ClinVar mutations in VHL, we developed a multiparametric scoring algorithm to evaluate the overall clinical severity of missense mutations in pVHL. The mutations were assessed according to eight weighted parameters as a comprehensive evaluation of protein misfolding and malfunction. Higher mutation scores were strongly associated with pathogenicity. Our approach establishes a novel in silico method by which VHL-specific mutations can be assessed for their severity and effect on the biophysical functions of the VHL protein.

ABSTRACT Human plasminogen (hPg)-binding M-protein (PAM), a major virulence factor of Pattern D Streptococcus pyogenes (GAS), is the primary receptor responsible for binding and activating hPg. PAM is covalently bound to the cell wall (CW) through cell membrane (CM)-resident sortase A (SrtA)-catalyzed cleavage of the PAM-proximal C-terminal LPST ↓ -GEAA motif present immediately upstream of its transmembrane domain (TMD), and subsequent transpeptidation to the CW. These steps expose the N-terminus of PAM to the extracellular milieu (EM) to interact with PAM ligands, e . g ., hPg. Previously, we found that inactivation of SrtA showed little reduction in functional binding of PAM to hPg, indicating that PAM retained in the cell membrane (CM) by the TMD nonetheless exposed its N-terminus to the EM. In the current study, we assessed the effects of mutating the Thr 4 (P1) residue of the SrtA-cleavage site in PAM (Thr 355 in PAM) to delay PAM in the CM in the presence of SrtA. Using rSrtA in vitro , LPS Y GEAA and LPS W GEAA peptides were shown to have low activities, while LPS T GEAA had the highest activity. Isolated CM fractions of AP53/ΔSrtA cells showed that LPS Y GEAA and LPS W GEAA peptides were cleaved at substantially faster rates than LPS T GEAA, even in CMs with an AP53/ΔSrtA/PAM[T 355 Y] double mutation, but the transpeptidation step did not occur. These results implicate another CM-resident enzyme that cleaves LPS Y GEAA and LPS W GEAA motifs, most likely LPXTGase, but cannot catalyze the transpeptidation step. We conclude that the natural P1 (Thr) of the SrtA cleavage site has evolved to dampen PAM from nonfunctional cleavage by LPXTGase. IMPORTANCE We show in this study that functional cleavage of the sortase A (SrtA) cleavage signal for M-protein, LPST*GEAA, in the Gram+ cell membrane, which allows transpeptidation of M-protein to the cell wall, as opposed to non-functional cleavage by the highly active cell membrane nonribosomal enzyme, LPXTGase, at the downstream G-residue, is highly dependent on the presence of T at position 4. From our studies, we conclude that Streptococcus pyogenes has evolved in a manner that maximized T at this position so that SrtA preferentially cleaved the sorting signal in order that the virulence factor, M-protein, was stabilized on the cell surface through covalent attachment to the cell wall.