Protein kinases control cellular decision processes by phosphorylating specific substrates. Thousands of in vivo phosphorylation sites have been identified, mostly by proteome-wide mapping. However, systematically matching these sites to specific kinases is presently infeasible, due to limited specificity of consensus motifs, and the influence of contextual factors, such as protein scaffolds, localization, and expression, on cellular substrate specificity. We have developed an approach (NetworKIN) that augments motif-based predictions with the network context of kinases and phosphoproteins. The latter provides 60%-80% of the computational capability to assign in vivo substrate specificity. NetworKIN pinpoints kinases responsible for specific phosphorylations and yields a 2.5-fold improvement in the accuracy with which phosphorylation networks can be constructed. Applying this approach to DNA damage signaling, we show that 53BP1 and Rad50 are phosphorylated by CDK1 and ATM, respectively. We describe a scalable strategy to evaluate predictions, which suggests that BCLAF1 is a GSK-3 substrate.

Chronic inflammation increases cancer risk. While it is clear that cell signaling elicited by inflammatory cytokines promotes tumor development, the impact of DNA damage production resulting from inflammation-associated reactive oxygen and nitrogen species (RONS) on tumor development has not been directly tested. RONS induce DNA damage that can be recognized by alkyladenine DNA glycosylase (Aag) to initiate base excision repair. Using a mouse model of episodic inflammatory bowel disease by repeated administration of dextran sulfate sodium in the drinking water, we show that Aag-mediated DNA repair prevents colonic epithelial damage and reduces the severity of dextran sulfate sodium-induced colon tumorigenesis. Importantly, DNA base lesions expected to be induced by RONS and recognized by Aag accumulated to higher levels in Aag-deficient animals following stimulation of colonic inflammation. Finally, as a test of the generality of this effect we show that Aag-deficient animals display more severe gastric lesions that are precursors of gastric cancer after chronic infection with Helicobacter pylori. These data demonstrate that the repair of DNA lesions formed by RONS during chronic inflammation is important for protection against colon carcinogenesis.

Certain Escherichia coli strains residing in the human gut produce colibactin, a small-molecule genotoxin implicated in colorectal cancer pathogenesis. However, colibactin's chemical structure and the molecular mechanism underlying its genotoxic effects have remained unknown for more than a decade. Here we combine an untargeted DNA adductomics approach with chemical synthesis to identify and characterize a covalent DNA modification from human cell lines treated with colibactin-producing E. coli Our data establish that colibactin alkylates DNA with an unusual electrophilic cyclopropane. We show that this metabolite is formed in mice colonized by colibactin-producing E. coli and is likely derived from an initially formed, unstable colibactin-DNA adduct. Our findings reveal a potential biomarker for colibactin exposure and provide mechanistic insights into how a gut microbe may contribute to colorectal carcinogenesis.

DNA chip technology enables simultaneous examination of how approximately 6,200 Saccharomyces cerevisiae gene transcript levels, representing the entire genome, respond to environmental change. By using chips bearing oligonucleotide arrays, we show that, after exposure to the alkylating agent methyl methanesulfonate, approximately 325 gene transcript levels are increased and approximately 76 are decreased. Of the 21 genes that already were known to be induced by a DNA-damaging agent, 18 can be scored as inducible in this data set, and surprisingly, most of the newly identified inducible genes are induced even more strongly than these 18. We examined 42 responsive and 8 nonresponsive ORFs by conventional Northern blotting, and 48 of these 50 ORFs responded as they did by DNA chip analysis, with magnitudes displaying a correlation coefficient of 0.79. Responsive genes fall into several expected and many unexpected categories. Evidence for the induction of a program to eliminate and replace alkylated proteins is presented.

ARID1A (the AT-rich interaction domain 1A, also known as BAF250a) is one of the most commonly mutated genes in cancer1,2. The majority of ARID1A mutations are inactivating mutations and lead to loss of ARID1A expression 3 , which makes ARID1A a poor therapeutic target. Therefore, it is of clinical importance to identify molecular consequences of ARID1A deficiency that create therapeutic vulnerabilities in ARID1A-mutant tumors. In a proteomic screen, we found that ARID1A interacts with mismatch repair (MMR) protein MSH2. ARID1A recruited MSH2 to chromatin during DNA replication and promoted MMR. Conversely, ARID1A inactivation compromised MMR and increased mutagenesis. ARID1A deficiency correlated with microsatellite instability genomic signature and a predominant C>T mutation pattern and increased mutation load across multiple human cancer types. Tumors formed by an ARID1A-deficient ovarian cancer cell line in syngeneic mice displayed increased mutation load, elevated numbers of tumor-infiltrating lymphocytes, and PD-L1 expression. Notably, treatment with anti-PD-L1 antibody reduced tumor burden and prolonged survival of mice bearing ARID1A-deficient but not ARID1A-wild-type ovarian tumors. Together, these results suggest ARID1A deficiency contributes to impaired MMR and mutator phenotype in cancer, and may cooperate with immune checkpoint blockade therapy.

Abstract Alkylating agents damage DNA and proteins and are widely used in cancer chemotherapy. While the cellular responses to alkylation-induced DNA damage have been explored, knowledge of how alkylation damage affects global cellular stress responses is still sparse. Here, we examined the effects of the alkylating agent methylmethane sulfonate (MMS) on gene expression in mouse liver taking advantage of mice deficient in alkyladenine DNA glycosylase (Aag), the enzyme that initiates the repair of alkylated DNA bases. MMS induced a robust transcriptional response in wild-type liver that included markers of the endoplasmic reticulum (ER) stress/unfolded protein response (UPR) known to be controlled by the transcription factor XBP1, a key UPR effector. Importantly, this response is significantly reduced in the Aag knockout. To investigate a potential role for AAG in alkylation-induced UPR, the expression of UPR markers after MMS treatment was interrogated in human glioblastoma cell lines expressing different AAG levels. Alkylation induced the UPR in cells expressing AAG; conversely, AAG knock-down compromised UPR induction and led to a defect in XBP1 activation plus a decrease in the expression of the ER chaperone BiP. To verify that the DNA repair activity of AAG is required for this response, AAG knockdown cells were complemented with wild-type Aag or with a mutant version of the Aag gene producing a glycosylase-deficient AAG protein. As expected, the glycosylase-defective mutant Aag does not fully protect AAG knockdown cells against MMS-induced cytotoxicity. Remarkably, however, alkylation-induced XBP1 activation is fully complemented by the catalytically inactive AAG enzyme. This work establishes that, in addition to its enzymatic activity, AAG has non-canonical functions in alkylation-induced UPR that contribute to the overall cellular response to alkylation. Significance Statement Stress response pathways, such as the DNA damage response (DDR) and the UPR, are critical in both the etiology and treatment of cancer and other chronic diseases. Knowledge of an interplay between ER stress and genome damage repair is emerging, but evidence linking defective DNA repair and impaired ER stress response is lacking. Here, we show that AAG is necessary for UPR activation in response to alkylating agents. AAG-deficient mice and human cancer cells are impaired in alkylation-induced UPR. Strikingly, this defect can be complemented by an AAG variant defective in glycosylase activity. Our studies suggest AAG has non-canonical functions and identify AAG as a point of convergence for stress response pathways. This knowledge could be explored to improve cancer treatment.

Base excision repair (BER) initiated by alkyladenine DNA glycosylase (AAG; aka MPG) is essential for removal of aberrantly methylated DNA bases. Genome instability and accumulation of aberrant bases accompany multiple diseases including cancer and neurological disorders. While BER is well studied on naked DNA, it remains unclear how BER efficiently operates on chromatin. Here we show that AAG binds to chromatin and forms complex with active RNA polymerase (pol) II. This occurs through direct interaction with Elongator and results in transcriptional co-regulation. Importantly, at co-regulated genes aberrantly methylated bases accumulate towards 3-end, in regions enriched for BER enzymes AAG and APE1, Elongator and active RNA pol II. Active transcription and functional Elongator are further crucial to ensure efficient BER, by promoting AAG and APE1 chromatin recruitment. Our findings provide novel insights to maintaining genome stability in actively transcribing chromatin, and reveal roles of aberrantly methylated bases in regulation of gene expression.

Summary N -nitrosodimethylamine (NDMA) is a DNA methylating agent that has been discovered to contaminate water, food and drugs. The alkyladenine glycosylase (AAG) removes methylated bases to initiate the base excision repair (BER) pathway. To understand how gene-environment interactions impact disease susceptibility, we studied Aag −/− and Aag -overexpressing mice that harbor increased levels of either replication-blocking lesions (3-methyladenine, or 3MeA) or strand breaks (BER intermediates), respectively. Remarkably, the disease outcome switched from cancer to lethality simply by changing AAG levels. To understand the underlying basis for this observation, we integrated a suite of molecular, cellular and physiological analyses. We found that unrepaired 3MeA is somewhat toxic but highly mutagenic (promoting cancer), whereas excess strand breaks are poorly mutagenic and highly toxic (suppressing cancer and promoting lethality). We demonstrate that the levels of a single DNA repair protein tips the balance between blocks and breaks, and thus dictates the disease consequences of DNA damage.